咪喹莫特對人皮膚鱗狀細胞癌SCL-1細胞株作用機制的研究 前言 皮膚鱗狀細胞癌是起源于角質形成細胞或附屬器鱗狀上皮細胞的惡性腫瘤，是最常見的皮膚惡性腫瘤之一，其發(fā)病率約占全部非黑素性皮膚細胞癌的20％。隨著Mohs′手術的應用和推廣，絕大部分皮膚鱗癌的治療可取得較好的效果，但對于某些不適于接受皮膚外科治療，如非典型的皮膚癌前病變、損害發(fā)生于外陰等特殊部位、皮損數(shù)量較多面積較大者，或者術后需要預防復發(fā)的病例，選擇適當有效的外用藥物進行局部治療便顯得非常重要。 咪喹莫特是一種非核苷類異環(huán)咪唑喹啉胺類藥物，臨床研究證實其外用制劑具有顯著的抗皮膚腫瘤活性。美國FDA已批準將咪喹莫特用于日光性角化和基底細胞癌的治療。有關咪喹莫特抗癌作用的具體機制仍不十分明了，一般認為，咪喹莫特主要是通過與免疫相關細胞表面的Toll樣受體結合、促進IFN-α、TNF-α、IL-12等多種前炎癥細胞因子的分泌，進而激活天然與獲得性免疫反應的方式發(fā)揮抗癌作用；進一步的研究發(fā)現(xiàn)，咪喹莫特尚能選擇性的抑制某些皮膚腫瘤細胞的增殖并誘導其凋亡，提示增殖抑制和誘導凋亡可能是評價咪喹莫特抗腫瘤作用的重要指標和機制。 本實驗以人皮膚鱗狀細胞癌SCL-1細胞株為靶細胞，觀察不同濃度的咪喹莫特對SCL-1細胞的增殖抑制作用和凋亡誘導作用，在掌握藥物作用前后SCL-1細胞Fas、bcl-2、hTERT、C-Myc基因表達變化的基礎上，分析咪喹莫特誘導皮膚鱗癌細胞凋亡和降低其端粒酶活性的機制以及兩者間的聯(lián)系，為臨床應用咪喹莫特治療皮膚鱗狀細胞癌提供有價值的依據(jù)。 實驗材料與方法 1、細胞培養(yǎng) SCL-1細胞使用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5％CO_2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，每日觀察細胞形態(tài)變化。 2、MTT檢測 SCL-1細胞以1×10~5／mL接種于96孔培養(yǎng)板中，實驗組細胞培養(yǎng)液濃度為含25μg／mL、50μg／mL、75μg／mL、100μg／mL、125μg／mL、150μg／mL、175μg／mL、200μg／mL和225μg／mL咪喹莫特的培養(yǎng)液，對照組細胞為不含咪喹莫特的培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(5μg／mL)試劑20μL，37℃孵育4h，中止培養(yǎng)，每孔加入DMSO 150μL，震蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測儀570nM處測定每孔吸光度值(OD)。抑制率(％)=(1-處理組OD值／對照組OD值)×100％ 3、細胞形態(tài)學觀察 取分別含0μg／mL、150μg／mL咪喹莫特的培養(yǎng)液，培養(yǎng)SCL-1細胞48h后于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并照相。 4、流式細胞儀測定細胞早期凋亡 SCL-1細胞以1×10~6個／孔接種于6孔培養(yǎng)板中，使用含0μg／mL、150μg／mL咪喹莫特的培養(yǎng)液培養(yǎng)12～48h，收集貼壁生長的細胞制成單細胞懸液，PBS洗兩次，分別加入5μL Annexin V／FITC和10μL濃度20μg／mL的PI溶液，混勻后室溫避光孵育15min，流式細胞儀檢測，結果用Cell Quest軟件分析。 5、Cell Death Detection ELISA kit檢測細胞凋亡率 將SCL-1細胞以1×10~6個／孔的密度接種于96孔板，用含50μg／mL、75μg／mL、100μg／mL、125μg／mL、150μg／mL咪喹莫特的培養(yǎng)液培養(yǎng)12h、24h和48h，至設定時間后將96孔板取出，離心(200×g，10min)并去孔內上清，每孔加入溶解緩沖液200μL，室溫孵育30min，重復離心并吸取孔內底部樣本20μL，加入涂敷有抗生物素蛋白鏈菌素的孔板中，孔板每孔加入含有抗-組蛋白-生物素、抗-DNA-POD和培養(yǎng)緩沖液的免疫反應劑80μL(組分構成比1：1：18)，振蕩(300 rpm)2h，傾盡殘液，培養(yǎng)緩沖液300μL洗滌3次，瀝干，每孔加入ABTS顯色溶液100μL，250rpm輕搖15min，使顯色充分，酶聯(lián)免疫檢測儀測定每孔490nM波長處的吸光度值。 6、丫啶橙熒光染色觀察細胞晚期凋亡 取經0μg／mL、150μg／mL咪喹莫特作用48h的SCL-1細胞，PBS洗滌1次，取95μL細胞懸液(1×10~7個／mL)加入5μL丫啶橙，混勻后吸1滴于潔凈載玻片上，立即在490nM波長的熒光顯微鏡下觀察。 7、端粒酶活性檢測 用TRAP-PCR-ELISA法進行端粒酶活性檢測，分別收集經濃度為0μg／mL、50μg／mL、75μg／mL、100μg／mL、125μg／mL、150μg／mL的咪喹莫特作用48h的SCL-1細胞，制備端粒酶提取液。RT-PCR擴增：引物延伸，取上述提取液6μg，加反應混合液，置25℃，30min。端粒酶的滅活，94℃，5min。PCR擴增，變性94℃，30s，退火50℃，30s，延伸72℃，90s，共30個循環(huán)。平衡，置72℃，10min。擴增產物的檢測，取5μL擴增產物，加20μL變性試劑，室溫10min。加入225μL雜交混合液(含地高辛標記的檢測探針)，充分混勻后，取100μL于抗生物素蛋白包被的微孔板上，37℃搖床雜交2h。加入過氧化物酶偶聯(lián)的抗地高辛抗體，室溫30min。TMB底物顯色10min，加中止液中止反應，測定450nM處的吸光度，連續(xù)檢測2次并取其均值。 8、細胞免疫組化和免疫熒光 0.25％胰酶消化后，收集經濃度為0μg／mL、15μg／mL的咪喹莫特作用48h的SCL-1細胞。PBS洗2次，細胞離心機1000rpm，5min，制做細胞甩片。丙酮4℃固定10min。0.3％H_2O_2溶液與標本室溫反應30min，抑制內源性過氧化物酶的活性。加入一抗分別為鼠抗人Fas、bcl-2、c-Myc；羊抗人TERT單抗，4℃過夜。PBS洗后分別加入辣根過氧化酶和FITC標記的IgG二抗，37℃孵育2小時。DAB顯色和熒光顯微鏡下觀察。 9、RT-PCR 取經0μg／mL、50μg／mL、150μg／mL咪喹莫特作用48h的人皮膚鱗癌SCL-1細胞，檢測相關基因Fas、bcl-2、hTERT、c-Myc mRNA水平的變化。 實驗結果 1、咪喹莫特對SCL-1細胞抑制作用 人皮膚鱗狀細胞癌SCL-1細胞對咪喹莫特敏感，隨著咪喹莫特藥物濃度的升高，細胞存活率降低，呈劑量依賴性。從細胞增殖抑制曲線中得出IC30和IC50值的咪喹莫特濃度分別為47μg／mL和152μg／mL。 2、細胞形態(tài)學觀察 150μg／mL咪喹莫特作用48h后SCL-1細胞體積縮小，胞膜皺縮，形態(tài)不規(guī)則，大多數(shù)細胞脫壁漂浮。細胞形態(tài)改變隨咪喹莫特作用濃度增高，作用時間延長而更趨明顯。 3、流式細胞儀測定細胞早期凋亡 150μg／mL咪喹莫特處理24h后，SCL-1細胞的早期凋亡現(xiàn)象最為明顯，Cell Quest軟件分析其24h細胞早期凋亡率為47.23％。 4、Cell Death Detection ELISA kit檢測細胞凋亡率 ELISA實驗結果顯示，SCL-1細胞凋亡程度隨咪喹莫特作用濃度增高、作用時間延長而逐漸升高，呈現(xiàn)明顯的量效和時效依賴性關系。細胞凋亡程度在不同藥物處理濃度和作用時間組間存在顯著性差異，即藥物濃度組間：F=15.96，P＜0.01；時間組間：F=15.78，＜0.01。 5、丫啶橙熒光染色觀察細胞晚期凋亡 熒光顯微鏡下觀察，對照組SCL-1細胞胞核呈黃綠色，核漿比例較大，胞漿為橙紅色；150μg／mL咪喹莫特作用48h后，細胞形態(tài)明顯不規(guī)則，胞核染色質呈黃綠色濃聚于核膜內側，核固縮、碎裂，細胞膜呈泡狀膨出，內可見凋亡小體。 6、端粒酶活性測定 TRAP-PCR-ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，SCL-1細胞端粒酶活性隨咪喹莫特作用濃度的增高而逐漸降低，呈現(xiàn)明顯的量效依賴性關系，不同濃度的咪喹莫特處理組間，SCL-1細胞端粒酶活性存在顯著的統(tǒng)計學差異F=615.90，P＜0.01。 7、細胞免疫組化和免疫熒光 細胞免疫組化染色顯示，經150μg／mL的咪喹莫特作用48h，F(xiàn)as蛋白表達水平上升；bcl-2和c-Myc蛋白表達下降；細胞免疫熒光顯示，TERT蛋白表達下降。 8、RT-PCR 隨著咪喹莫特作用濃度的增高，藥物處理48h后皮膚鱗癌SCL-1細胞中相關基因bcl-2、c-Myc、hTERT的mRNA表達水平逐漸降低，F(xiàn)as表達逐漸升高，差異均有顯著性P＜0.01。 結論 1、咪喹莫特可抑制體外培養(yǎng)的人皮膚鱗狀細胞癌SCL-1細胞株增殖并誘導其凋亡，且在一定范圍內呈時間濃度依賴性。 2、咪喹莫特可使體外培養(yǎng)的人皮膚鱗狀細胞癌SCL-1細胞株bcl-2 mRNA及蛋白的表達水平下調，F(xiàn)as mRNA及蛋白的表達水平上調，并在一定范圍內呈濃度依賴性。 3、咪喹莫特可使體外培養(yǎng)的人皮膚鱗狀細胞癌SCL-1細胞株hTERT mRNA及蛋白的表達水平下調，且SCL-1細胞凋亡程度與hTERT表達呈顯著負相關。 4、咪喹莫特可降低體外培養(yǎng)的人皮膚鱗狀細胞癌SCL-1細胞株端粒酶活性，并具有濃度依賴性。 5、咪喹莫特可使體外培養(yǎng)的人皮膚鱗狀細胞癌SCL-1細胞株c-Myc mRNA及蛋白的表達水平降低，并在一定范圍內呈濃度依賴性。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2007
【中圖分類】：R739.5
【部分圖文】：

式圖右下象限)，與對照組比較(圖3A)，150林留血L咪哇莫特處理24h后，scL一1細胞的早期凋亡現(xiàn)象最為明顯， CellQuest軟件分析其24h細胞早期凋亡率為47.23%(圖3B)。

3、咪喳莫特誘導SCL一1細胞早期凋亡情況流式細胞儀檢測顯示，早期凋亡細胞以FITC標記的AnnecxinV染色為主(流式圖右下象限)，與對照組比較(圖3A)，150林留血L咪哇莫特處理24h后，scL一1細胞的早期凋亡現(xiàn)象最為明顯， CellQuest軟件分析其24h細胞早期凋亡率為47.23%(圖3B)。

(圖4A);150林留mL咪哇莫特作用48h后，細胞形態(tài)明顯不規(guī)則，胞核染色質呈黃綠色濃聚于核膜內側，核固縮、碎裂，細胞膜呈泡狀膨出，內可見凋亡小體(圖4B)。
【共引文獻】

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本文編號：2836579