發(fā)布時間：2020-10-11 12:15

　　 咪喹莫特對人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞株作用機(jī)制的研究 前言 皮膚鱗狀細(xì)胞癌是起源于角質(zhì)形成細(xì)胞或附屬器鱗狀上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，是最常見的皮膚惡性腫瘤之一，其發(fā)病率約占全部非黑素性皮膚細(xì)胞癌的20％。隨著Mohs′手術(shù)的應(yīng)用和推廣，絕大部分皮膚鱗癌的治療可取得較好的效果，但對于某些不適于接受皮膚外科治療，如非典型的皮膚癌前病變、損害發(fā)生于外陰等特殊部位、皮損數(shù)量較多面積較大者，或者術(shù)后需要預(yù)防復(fù)發(fā)的病例，選擇適當(dāng)有效的外用藥物進(jìn)行局部治療便顯得非常重要。 咪喹莫特是一種非核苷類異環(huán)咪唑喹啉胺類藥物，臨床研究證實(shí)其外用制劑具有顯著的抗皮膚腫瘤活性。美國FDA已批準(zhǔn)將咪喹莫特用于日光性角化和基底細(xì)胞癌的治療。有關(guān)咪喹莫特抗癌作用的具體機(jī)制仍不十分明了，一般認(rèn)為，咪喹莫特主要是通過與免疫相關(guān)細(xì)胞表面的Toll樣受體結(jié)合、促進(jìn)IFN-α、TNF-α、IL-12等多種前炎癥細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而激活天然與獲得性免疫反應(yīng)的方式發(fā)揮抗癌作用；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，咪喹莫特尚能選擇性的抑制某些皮膚腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，提示增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡可能是評價咪喹莫特抗腫瘤作用的重要指標(biāo)和機(jī)制。 本實(shí)驗(yàn)以人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞株為靶細(xì)胞，觀察不同濃度的咪喹莫特對SCL-1細(xì)胞的增殖抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用，在掌握藥物作用前后SCL-1細(xì)胞Fas、bcl-2、hTERT、C-Myc基因表達(dá)變化的基礎(chǔ)上，分析咪喹莫特誘導(dǎo)皮膚鱗癌細(xì)胞凋亡和降低其端粒酶活性的機(jī)制以及兩者間的聯(lián)系，為臨床應(yīng)用咪喹莫特治療皮膚鱗狀細(xì)胞癌提供有價值的依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料與方法 1、細(xì)胞培養(yǎng) SCL-1細(xì)胞使用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5％CO_2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞形態(tài)變化。 2、MTT檢測 SCL-1細(xì)胞以1×10~5／mL接種于96孔培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液濃度為含25μg／mL、50μg／mL、75μg／mL、100μg／mL、125μg／mL、150μg／mL、175μg／mL、200μg／mL和225μg／mL咪喹莫特的培養(yǎng)液，對照組細(xì)胞為不含咪喹莫特的培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(5μg／mL)試劑20μL，37℃孵育4h，中止培養(yǎng)，每孔加入DMSO 150μL，震蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測儀570nM處測定每孔吸光度值(OD)。抑制率(％)=(1-處理組OD值／對照組OD值)×100％ 3、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取分別含0μg／mL、150μg／mL咪喹莫特的培養(yǎng)液，培養(yǎng)SCL-1細(xì)胞48h后于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并照相。 4、流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞早期凋亡 SCL-1細(xì)胞以1×10~6個／孔接種于6孔培養(yǎng)板中，使用含0μg／mL、150μg／mL咪喹莫特的培養(yǎng)液培養(yǎng)12～48h，收集貼壁生長的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，PBS洗兩次，分別加入5μL Annexin V／FITC和10μL濃度20μg／mL的PI溶液，混勻后室溫避光孵育15min，流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果用Cell Quest軟件分析。 5、Cell Death Detection ELISA kit檢測細(xì)胞凋亡率 將SCL-1細(xì)胞以1×10~6個／孔的密度接種于96孔板，用含50μg／mL、75μg／mL、100μg／mL、125μg／mL、150μg／mL咪喹莫特的培養(yǎng)液培養(yǎng)12h、24h和48h，至設(shè)定時間后將96孔板取出，離心(200×g，10min)并去孔內(nèi)上清，每孔加入溶解緩沖液200μL，室溫孵育30min，重復(fù)離心并吸取孔內(nèi)底部樣本20μL，加入涂敷有抗生物素蛋白鏈菌素的孔板中，孔板每孔加入含有抗-組蛋白-生物素、抗-DNA-POD和培養(yǎng)緩沖液的免疫反應(yīng)劑80μL(組分構(gòu)成比1：1：18)，振蕩(300 rpm)2h，傾盡殘液，培養(yǎng)緩沖液300μL洗滌3次，瀝干，每孔加入ABTS顯色溶液100μL，250rpm輕搖15min，使顯色充分，酶聯(lián)免疫檢測儀測定每孔490nM波長處的吸光度值。 6、丫啶橙熒光染色觀察細(xì)胞晚期凋亡 取經(jīng)0μg／mL、150μg／mL咪喹莫特作用48h的SCL-1細(xì)胞，PBS洗滌1次，取95μL細(xì)胞懸液(1×10~7個／mL)加入5μL丫啶橙，混勻后吸1滴于潔凈載玻片上，立即在490nM波長的熒光顯微鏡下觀察。 7、端粒酶活性檢測 用TRAP-PCR-ELISA法進(jìn)行端粒酶活性檢測，分別收集經(jīng)濃度為0μg／mL、50μg／mL、75μg／mL、100μg／mL、125μg／mL、150μg／mL的咪喹莫特作用48h的SCL-1細(xì)胞，制備端粒酶提取液。RT-PCR擴(kuò)增：引物延伸，取上述提取液6μg，加反應(yīng)混合液，置25℃，30min。端粒酶的滅活，94℃，5min。PCR擴(kuò)增，變性94℃，30s，退火50℃，30s，延伸72℃，90s，共30個循環(huán)。平衡，置72℃，10min。擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，加20μL變性試劑，室溫10min。加入225μL雜交混合液(含地高辛標(biāo)記的檢測探針)，充分混勻后，取100μL于抗生物素蛋白包被的微孔板上，37℃搖床雜交2h。加入過氧化物酶偶聯(lián)的抗地高辛抗體，室溫30min。TMB底物顯色10min，加中止液中止反應(yīng)，測定450nM處的吸光度，連續(xù)檢測2次并取其均值。 8、細(xì)胞免疫組化和免疫熒光 0.25％胰酶消化后，收集經(jīng)濃度為0μg／mL、15μg／mL的咪喹莫特作用48h的SCL-1細(xì)胞。PBS洗2次，細(xì)胞離心機(jī)1000rpm，5min，制做細(xì)胞甩片。丙酮4℃固定10min。0.3％H_2O_2溶液與標(biāo)本室溫反應(yīng)30min，抑制內(nèi)源性過氧化物酶的活性。加入一抗分別為鼠抗人Fas、bcl-2、c-Myc；羊抗人TERT單抗，4℃過夜。PBS洗后分別加入辣根過氧化酶和FITC標(biāo)記的IgG二抗，37℃孵育2小時。DAB顯色和熒光顯微鏡下觀察。 9、RT-PCR 取經(jīng)0μg／mL、50μg／mL、150μg／mL咪喹莫特作用48h的人皮膚鱗癌SCL-1細(xì)胞，檢測相關(guān)基因Fas、bcl-2、hTERT、c-Myc mRNA水平的變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、咪喹莫特對SCL-1細(xì)胞抑制作用 人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞對咪喹莫特敏感，隨著咪喹莫特藥物濃度的升高，細(xì)胞存活率降低，呈劑量依賴性。從細(xì)胞增殖抑制曲線中得出IC30和IC50值的咪喹莫特濃度分別為47μg／mL和152μg／mL。 2、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 150μg／mL咪喹莫特作用48h后SCL-1細(xì)胞體積縮小，胞膜皺縮，形態(tài)不規(guī)則，大多數(shù)細(xì)胞脫壁漂浮。細(xì)胞形態(tài)改變隨咪喹莫特作用濃度增高，作用時間延長而更趨明顯。 3、流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞早期凋亡 150μg／mL咪喹莫特處理24h后，SCL-1細(xì)胞的早期凋亡現(xiàn)象最為明顯，Cell Quest軟件分析其24h細(xì)胞早期凋亡率為47.23％。 4、Cell Death Detection ELISA kit檢測細(xì)胞凋亡率 ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SCL-1細(xì)胞凋亡程度隨咪喹莫特作用濃度增高、作用時間延長而逐漸升高，呈現(xiàn)明顯的量效和時效依賴性關(guān)系。細(xì)胞凋亡程度在不同藥物處理濃度和作用時間組間存在顯著性差異，即藥物濃度組間：F=15.96，P＜0.01；時間組間：F=15.78，＜0.01。 5、丫啶橙熒光染色觀察細(xì)胞晚期凋亡 熒光顯微鏡下觀察，對照組SCL-1細(xì)胞胞核呈黃綠色，核漿比例較大，胞漿為橙紅色；150μg／mL咪喹莫特作用48h后，細(xì)胞形態(tài)明顯不規(guī)則，胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚于核膜內(nèi)側(cè)，核固縮、碎裂，細(xì)胞膜呈泡狀膨出，內(nèi)可見凋亡小體。 6、端粒酶活性測定 TRAP-PCR-ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，SCL-1細(xì)胞端粒酶活性隨咪喹莫特作用濃度的增高而逐漸降低，呈現(xiàn)明顯的量效依賴性關(guān)系，不同濃度的咪喹莫特處理組間，SCL-1細(xì)胞端粒酶活性存在顯著的統(tǒng)計學(xué)差異F=615.90，P＜0.01。 7、細(xì)胞免疫組化和免疫熒光 細(xì)胞免疫組化染色顯示，經(jīng)150μg／mL的咪喹莫特作用48h，F(xiàn)as蛋白表達(dá)水平上升；bcl-2和c-Myc蛋白表達(dá)下降；細(xì)胞免疫熒光顯示，TERT蛋白表達(dá)下降。 8、RT-PCR 隨著咪喹莫特作用濃度的增高，藥物處理48h后皮膚鱗癌SCL-1細(xì)胞中相關(guān)基因bcl-2、c-Myc、hTERT的mRNA表達(dá)水平逐漸降低，F(xiàn)as表達(dá)逐漸升高，差異均有顯著性P＜0.01。 結(jié)論 1、咪喹莫特可抑制體外培養(yǎng)的人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞株增殖并誘導(dǎo)其凋亡，且在一定范圍內(nèi)呈時間濃度依賴性。 2、咪喹莫特可使體外培養(yǎng)的人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞株bcl-2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平下調(diào)，F(xiàn)as mRNA及蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，并在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性。 3、咪喹莫特可使體外培養(yǎng)的人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞株hTERT mRNA及蛋白的表達(dá)水平下調(diào)，且SCL-1細(xì)胞凋亡程度與hTERT表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。 4、咪喹莫特可降低體外培養(yǎng)的人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞株端粒酶活性，并具有濃度依賴性。 5、咪喹莫特可使體外培養(yǎng)的人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞株c-Myc mRNA及蛋白的表達(dá)水平降低，并在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2007
【中圖分類】：R739.5
【部分圖文】：

式圖右下象限)，與對照組比較(圖3A)，150林留血L咪哇莫特處理24h后，scL一1細(xì)胞的早期凋亡現(xiàn)象最為明顯， CellQuest軟件分析其24h細(xì)胞早期凋亡率為47.23%(圖3B)。

3、咪喳莫特誘導(dǎo)SCL一1細(xì)胞早期凋亡情況流式細(xì)胞儀檢測顯示，早期凋亡細(xì)胞以FITC標(biāo)記的AnnecxinV染色為主(流式圖右下象限)，與對照組比較(圖3A)，150林留血L咪哇莫特處理24h后，scL一1細(xì)胞的早期凋亡現(xiàn)象最為明顯， CellQuest軟件分析其24h細(xì)胞早期凋亡率為47.23%(圖3B)。

(圖4A);150林留mL咪哇莫特作用48h后，細(xì)胞形態(tài)明顯不規(guī)則，胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚于核膜內(nèi)側(cè)，核固縮、碎裂，細(xì)胞膜呈泡狀膨出，內(nèi)可見凋亡小體(圖4B)。
【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2836579