一、研究背景與目的 位于毛囊基底部的特殊間質(zhì)成分毛乳頭細(xì)胞(dermal papilla cell,DPC)在毛囊發(fā)育和周期性再生調(diào)控中起主導(dǎo)作用。在胚胎期,DPC產(chǎn)生多種針對表皮的調(diào)節(jié)因子,促使表皮細(xì)胞增生分化形成毛囊。出生后毛囊的周期性再生過程中誘導(dǎo)上皮細(xì)胞增殖和分化的信號也來自DPC。誘導(dǎo)毛囊形成是DPC最為顯著的功能特征,DPC功能的異常變化是導(dǎo)致毛囊周期失衡和脫發(fā)現(xiàn)象的主要起始因素。因此對DPC生物學(xué)功能變化的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究,對毛囊生物學(xué)和毛發(fā)疾病的研究都有重大的意義。相關(guān)研究先后鑒定出數(shù)十種與DPC相關(guān)的調(diào)控因子,這些調(diào)控因子在DPC和毛囊上皮細(xì)胞的相互作用中構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),但尚不能確定其中具有關(guān)鍵作用的因子或調(diào)控途徑。 研究表明,細(xì)胞在不同的生物學(xué)功能狀態(tài)中表達(dá)的基因不同,基因表達(dá)的有序性、選擇性是細(xì)胞功能變化的內(nèi)在根據(jù)。因此,通過分析不同狀態(tài)下DPC基因表達(dá)的差異,可為揭示DPC生物學(xué)功能調(diào)控規(guī)律提供重要信息。獲取差異表達(dá)的基因?qū)⒂兄诹私釪PC在生理和病理?xiàng)l件下功能變化的分子機(jī)制,為毛囊發(fā)育和毛囊周期性生長調(diào)控研究提供新的視野。 在以往的研究中,本課題組使用抑制性消減雜交技術(shù)(SSH)結(jié)合SMARTTM cDNA合成技術(shù)對人活體組織中休止期毛囊DPC及生長期毛囊DPC mRNA的表達(dá)差異進(jìn)行了研究。SSH方法通過兩輪雜交和抑制性PCR,可對兩個樣本的基因表達(dá)進(jìn)行有效對比。運(yùn)用SMARTTM cDNA合成技術(shù)合成cDNA,使對活體組織毛乳頭標(biāo)本進(jìn)行基因表達(dá)差異研究成為可能。最終我們成功建立了毛乳頭差異表達(dá)cDNA文庫,為進(jìn)一步闡述DPC功能調(diào)控的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 從所建立的毛乳頭差異表達(dá)cDNA文庫中,我們首次發(fā)現(xiàn)了Wnt信號通路關(guān)鍵信號分子T細(xì)胞因子4(T cell factor4,TCF4)作為生長期毛囊DPC的上調(diào)表達(dá)基因,并使用反向Northern實(shí)驗(yàn)對該結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。TCF4在DPC中差異表達(dá)為首次發(fā)現(xiàn),生物學(xué)意義尚不明了。本課題擬研究DPC在凝集性生長和非凝集性生長狀態(tài)下的TCF4基因表達(dá)差異,以及對TCF4基因在DPC生物學(xué)功能調(diào)控中的作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。 二、方法與結(jié)果 1.TCF4基因在毛囊DPC中的表達(dá) 首先應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測斑禿患者和正常人頭皮組織的TCF4基因的表達(dá);應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)檢測凝集性生長和非凝集性生長的人DPC的TCF4蛋白的表達(dá);RT-PCR的方法從上述兩種細(xì)胞的總RNA擴(kuò)增TCF4基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TCF4基因在正常頭皮組織毛囊DPC表達(dá),而在斑禿組織毛囊的DPC不表達(dá);TCF4基因在凝集性生長期DPC中表達(dá),而在非凝集性生長期DPC不表達(dá)。表明TCF4基因在生長期DPC中高水平表達(dá)。 2.pcDNA3.0-TCF4表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá) 為了研究TCF4基因?qū)PC增殖的影響,我們構(gòu)建了pcDNA3.0-TCF4表達(dá)載體。首先從凝集性生長DPC中提取總RNA,RT-PCR獲得帶有酶切位點(diǎn)的TCF4基因克隆,亞克隆入pcDNA3.0載體中,并通過雙酶切和測序進(jìn)行鑒定。利用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染到DPC中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá),檢測轉(zhuǎn)染前后TCF4表達(dá)的變化。以未轉(zhuǎn)染的DPC作為對照組,分別用流式細(xì)胞儀檢測DPC細(xì)胞周期的變化,Western blot檢測DPC的肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、干細(xì)胞生長因子(stem cell factor, SCF)的表達(dá),MTT比色法檢測細(xì)胞生長曲線,3H-TdR檢測細(xì)胞增殖。結(jié)果表明,我們從DPC中獲得TCF4基因克隆并且成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體。經(jīng)過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,DPC中TCF4在mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào)。與對照組相比,DPC的增殖能力和相關(guān)細(xì)胞因子的分泌能力得到明顯提高。結(jié)果表明,TCF4基因可以促進(jìn)DPC增殖和分泌細(xì)胞因子的功能。 3.RNA干擾抑制TCF4表達(dá)對DPC生物學(xué)功能的影響 為了進(jìn)一步探討TCF4的表達(dá)對DPC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,我們采用化學(xué)合成法合成3對TCF4 siRNA,并轉(zhuǎn)染DPC。采用半定量RT-PCR及Western blot分別從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測DPC TCF4的表達(dá)情況。以未轉(zhuǎn)染siRNA的DPC作為對照組,用流式細(xì)胞儀檢測DPC細(xì)胞周期的變化,Western blot檢測DPC的胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)和SCF的表達(dá),MTT比色法檢測細(xì)胞生長曲線,3H-TdR檢測細(xì)胞增殖。結(jié)果表明與空白對照組相比,3組序列的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均有明顯降低,以序列2組下降明顯。細(xì)胞增殖能力均顯著下降(P0.05),IGF-1、SCF表達(dá)明顯降低,而對照組無顯著性差異。結(jié)果表明TCF4 siRNA能顯著下調(diào)DPC TCF4的表達(dá),降低DPC的增殖能力,進(jìn)一步提示TCF4在DPC生長調(diào)控中可能起到重要作用。 三、結(jié)論 1. TCF4基因在生長期DPC中高表達(dá)。 2. TCF4基因在DPC中過表達(dá)使其細(xì)胞周期、生長曲線明顯改變,細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng),并促進(jìn)DPC分泌細(xì)胞因子。 3.通過RNA干擾降低TCF4基因的表達(dá),可使DPC細(xì)胞增殖減慢,相關(guān)細(xì)胞因子的分泌受到抑制。 通過以上實(shí)驗(yàn),為深入了解TCF4基因以及Wnt信號在毛囊周期性調(diào)控中的作用和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R751
【部分圖文】：

圖 1 Wnt 信號傳導(dǎo)途徑示意圖研究擬對斑禿患者和正常人頭皮組織進(jìn)行原位雜交技術(shù)檢測；對凝集性生長集性生長的人DPC分別進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)檢測；RT-PCR的方法從上述兩種細(xì)胞增TCF4基因，從而了解TCF4基因在DPC中的表達(dá)情況。我們擬構(gòu)建TCF4 / pcDN載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到DPC中進(jìn)行表達(dá),檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染前后TCF4表達(dá)的變化。同時采合成法合成TCF4 siRNA，并轉(zhuǎn)染DPC細(xì)胞，采用半定量RT-PCR及Western blotNA和蛋白質(zhì)水平檢測DPC TCF4的表達(dá)情況。以未轉(zhuǎn)染的DPC細(xì)胞作為對照組，式細(xì)胞術(shù)檢測DPC細(xì)胞周期的變化，Western blot檢測相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，法檢測細(xì)胞生長曲線，3H-TdR檢測細(xì)胞增殖，從而了解TCF4對DPC生物學(xué)功能通過以上實(shí)驗(yàn)，為進(jìn)一步研究毛囊周期性生長的機(jī)制，尋求脫發(fā)新的治療靶點(diǎn)要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。總體研究思路見圖2。

圖 2 TCF4 在毛囊 DPC 中的表達(dá)及其功能研究總體思路示意圖參考文獻(xiàn) Peus D,Pittelkow MR. Growth factors in hair organ development and the hair growth cycle. Clin. Dermatol Clin[J]. 1996;14(4):559. Yang XC(楊希川), Hao F, Zhong BY, et al. Identification of differentially expressed genes idermal papilla by suppression subtractive hybridization[J]. Chin Med J 2004;117(4):371-375. Oro AE, Higgins K. Hair cycle regulation of Hedgehog signal reception[J]. De2003;255(3):238-248. Thomson M, McCarroll J, Bond J, et al. Parathyroid hormone-related peptide modulates signal

圖 1-1 新分離的毛乳頭(100×) 圖 1-2 貼壁 24h 后 DPC(100×)圖 1-3 貼壁 72h 后的 DPC(100×) 圖 1-4 DPC 充分生長后的狀態(tài)(100×)二、組織內(nèi) mRNA 原位雜交

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 麥躍,劉榮卿,伍津津,程波,唐書謙,鐘白玉;毛乳頭細(xì)胞凝集性生長對誘導(dǎo)毛囊樣結(jié)構(gòu)形成能力的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2004年13期

2 王宏,黎衛(wèi)平,高云荷;子宮內(nèi)膜癌中β-連環(huán)素表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系[J];臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志;2003年02期

3 夏汝山;郝飛;尹銳;宋志強(qiáng);鄒鋒;鐘白玉;;HSPCO16重組蛋白對毛乳頭細(xì)胞增殖的影響[J];中國皮膚性病學(xué)雜志;2007年01期

4 楊希川,郝飛,程波,宋志強(qiáng),楊衛(wèi)兵,向明明;應(yīng)用抑制性消減雜交方法構(gòu)建斑禿毛乳頭差異表達(dá)基因文庫[J];中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志;2002年04期

5 伍津津,劉榮卿,葉慶佾,鐘白玉,唐書謙;毛乳頭細(xì)胞高效培養(yǎng)方法探索[J];中華皮膚科雜志;1997年06期

6 劉榮卿,唐書謙,鐘白玉,葉慶佾,伍津津;人毛乳頭細(xì)胞體外培養(yǎng)生長曲線觀察[J];中華皮膚科雜志;2001年01期

7 程波,劉榮卿,伍津津,麥躍,鐘白玉,唐書謙;改良毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)法[J];中華皮膚科雜志;2001年05期

8 鐘白玉,楊衛(wèi)兵,楊希川,郝飛,伍津津;二步酶消化法分離人頭皮毛乳頭細(xì)胞[J];中華皮膚科雜志;2003年07期

9 楊希川,郝飛,楊衛(wèi)兵,宋志強(qiáng),程波,鐘白玉,向明明;抑制性消減雜交篩選生長期毛乳頭細(xì)胞差異表達(dá)基因[J];中華皮膚科雜志;2004年11期

10 王繼文,宋志強(qiáng),楊希川,麥躍,郝飛;毛乳頭細(xì)胞凝聚性生長差異表達(dá)基因的篩選及HSPC016全長克隆的生物信息學(xué)分析[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2004年18期

本文編號：2833909