一、研究背景與目的 位于毛囊基底部的特殊間質(zhì)成分毛乳頭細(xì)胞(dermal papilla cell,DPC)在毛囊發(fā)育和周期性再生調(diào)控中起主導(dǎo)作用。在胚胎期,DPC產(chǎn)生多種針對(duì)表皮的調(diào)節(jié)因子,促使表皮細(xì)胞增生分化形成毛囊。出生后毛囊的周期性再生過(guò)程中誘導(dǎo)上皮細(xì)胞增殖和分化的信號(hào)也來(lái)自DPC。誘導(dǎo)毛囊形成是DPC最為顯著的功能特征,DPC功能的異常變化是導(dǎo)致毛囊周期失衡和脫發(fā)現(xiàn)象的主要起始因素。因此對(duì)DPC生物學(xué)功能變化的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究,對(duì)毛囊生物學(xué)和毛發(fā)疾病的研究都有重大的意義。相關(guān)研究先后鑒定出數(shù)十種與DPC相關(guān)的調(diào)控因子,這些調(diào)控因子在DPC和毛囊上皮細(xì)胞的相互作用中構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),但尚不能確定其中具有關(guān)鍵作用的因子或調(diào)控途徑。 研究表明,細(xì)胞在不同的生物學(xué)功能狀態(tài)中表達(dá)的基因不同,基因表達(dá)的有序性、選擇性是細(xì)胞功能變化的內(nèi)在根據(jù)。因此,通過(guò)分析不同狀態(tài)下DPC基因表達(dá)的差異,可為揭示DPC生物學(xué)功能調(diào)控規(guī)律提供重要信息。獲取差異表達(dá)的基因?qū)⒂兄诹私釪PC在生理和病理?xiàng)l件下功能變化的分子機(jī)制,為毛囊發(fā)育和毛囊周期性生長(zhǎng)調(diào)控研究提供新的視野。 在以往的研究中,本課題組使用抑制性消減雜交技術(shù)(SSH)結(jié)合SMARTTM cDNA合成技術(shù)對(duì)人活體組織中休止期毛囊DPC及生長(zhǎng)期毛囊DPC mRNA的表達(dá)差異進(jìn)行了研究。SSH方法通過(guò)兩輪雜交和抑制性PCR,可對(duì)兩個(gè)樣本的基因表達(dá)進(jìn)行有效對(duì)比。運(yùn)用SMARTTM cDNA合成技術(shù)合成cDNA,使對(duì)活體組織毛乳頭標(biāo)本進(jìn)行基因表達(dá)差異研究成為可能。最終我們成功建立了毛乳頭差異表達(dá)cDNA文庫(kù),為進(jìn)一步闡述DPC功能調(diào)控的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 從所建立的毛乳頭差異表達(dá)cDNA文庫(kù)中,我們首次發(fā)現(xiàn)了Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)分子T細(xì)胞因子4(T cell factor4,TCF4)作為生長(zhǎng)期毛囊DPC的上調(diào)表達(dá)基因,并使用反向Northern實(shí)驗(yàn)對(duì)該結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。TCF4在DPC中差異表達(dá)為首次發(fā)現(xiàn),生物學(xué)意義尚不明了。本課題擬研究DPC在凝集性生長(zhǎng)和非凝集性生長(zhǎng)狀態(tài)下的TCF4基因表達(dá)差異,以及對(duì)TCF4基因在DPC生物學(xué)功能調(diào)控中的作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。 二、方法與結(jié)果 1.TCF4基因在毛囊DPC中的表達(dá) 首先應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測(cè)斑禿患者和正常人頭皮組織的TCF4基因的表達(dá);應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)凝集性生長(zhǎng)和非凝集性生長(zhǎng)的人DPC的TCF4蛋白的表達(dá);RT-PCR的方法從上述兩種細(xì)胞的總RNA擴(kuò)增TCF4基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TCF4基因在正常頭皮組織毛囊DPC表達(dá),而在斑禿組織毛囊的DPC不表達(dá);TCF4基因在凝集性生長(zhǎng)期DPC中表達(dá),而在非凝集性生長(zhǎng)期DPC不表達(dá)。表明TCF4基因在生長(zhǎng)期DPC中高水平表達(dá)。 2.pcDNA3.0-TCF4表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá) 為了研究TCF4基因?qū)PC增殖的影響,我們構(gòu)建了pcDNA3.0-TCF4表達(dá)載體。首先從凝集性生長(zhǎng)DPC中提取總RNA,RT-PCR獲得帶有酶切位點(diǎn)的TCF4基因克隆,亞克隆入pcDNA3.0載體中,并通過(guò)雙酶切和測(cè)序進(jìn)行鑒定。利用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染到DPC中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá),檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后TCF4表達(dá)的變化。以未轉(zhuǎn)染的DPC作為對(duì)照組,分別用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DPC細(xì)胞周期的變化,Western blot檢測(cè)DPC的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(stem cell factor, SCF)的表達(dá),MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,3H-TdR檢測(cè)細(xì)胞增殖。結(jié)果表明,我們從DPC中獲得TCF4基因克隆并且成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體。經(jīng)過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,DPC中TCF4在mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào)。與對(duì)照組相比,DPC的增殖能力和相關(guān)細(xì)胞因子的分泌能力得到明顯提高。結(jié)果表明,TCF4基因可以促進(jìn)DPC增殖和分泌細(xì)胞因子的功能。 3.RNA干擾抑制TCF4表達(dá)對(duì)DPC生物學(xué)功能的影響 為了進(jìn)一步探討TCF4的表達(dá)對(duì)DPC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,我們采用化學(xué)合成法合成3對(duì)TCF4 siRNA,并轉(zhuǎn)染DPC。采用半定量RT-PCR及Western blot分別從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)DPC TCF4的表達(dá)情況。以未轉(zhuǎn)染siRNA的DPC作為對(duì)照組,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DPC細(xì)胞周期的變化,Western blot檢測(cè)DPC的胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)和SCF的表達(dá),MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,3H-TdR檢測(cè)細(xì)胞增殖。結(jié)果表明與空白對(duì)照組相比,3組序列的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均有明顯降低,以序列2組下降明顯。細(xì)胞增殖能力均顯著下降(P0.05),IGF-1、SCF表達(dá)明顯降低,而對(duì)照組無(wú)顯著性差異。結(jié)果表明TCF4 siRNA能顯著下調(diào)DPC TCF4的表達(dá),降低DPC的增殖能力,進(jìn)一步提示TCF4在DPC生長(zhǎng)調(diào)控中可能起到重要作用。 三、結(jié)論 1. TCF4基因在生長(zhǎng)期DPC中高表達(dá)。 2. TCF4基因在DPC中過(guò)表達(dá)使其細(xì)胞周期、生長(zhǎng)曲線明顯改變,細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng),并促進(jìn)DPC分泌細(xì)胞因子。 3.通過(guò)RNA干擾降低TCF4基因的表達(dá),可使DPC細(xì)胞增殖減慢,相關(guān)細(xì)胞因子的分泌受到抑制。 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn),為深入了解TCF4基因以及Wnt信號(hào)在毛囊周期性調(diào)控中的作用和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R751
【部分圖文】：

圖 1 Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)途徑示意圖研究擬對(duì)斑禿患者和正常人頭皮組織進(jìn)行原位雜交技術(shù)檢測(cè)；對(duì)凝集性生長(zhǎng)集性生長(zhǎng)的人DPC分別進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)；RT-PCR的方法從上述兩種細(xì)胞增TCF4基因，從而了解TCF4基因在DPC中的表達(dá)情況。我們擬構(gòu)建TCF4 / pcDN載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到DPC中進(jìn)行表達(dá),檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染前后TCF4表達(dá)的變化。同時(shí)采合成法合成TCF4 siRNA，并轉(zhuǎn)染DPC細(xì)胞，采用半定量RT-PCR及Western blotNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)DPC TCF4的表達(dá)情況。以未轉(zhuǎn)染的DPC細(xì)胞作為對(duì)照組，式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DPC細(xì)胞周期的變化，Western blot檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，3H-TdR檢測(cè)細(xì)胞增殖，從而了解TCF4對(duì)DPC生物學(xué)功能通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，為進(jìn)一步研究毛囊周期性生長(zhǎng)的機(jī)制，尋求脫發(fā)新的治療靶點(diǎn)要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。總體研究思路見(jiàn)圖2。

圖 2 TCF4 在毛囊 DPC 中的表達(dá)及其功能研究總體思路示意圖參考文獻(xiàn) Peus D,Pittelkow MR. Growth factors in hair organ development and the hair growth cycle. Clin. Dermatol Clin[J]. 1996;14(4):559. Yang XC(楊希川), Hao F, Zhong BY, et al. Identification of differentially expressed genes idermal papilla by suppression subtractive hybridization[J]. Chin Med J 2004;117(4):371-375. Oro AE, Higgins K. Hair cycle regulation of Hedgehog signal reception[J]. De2003;255(3):238-248. Thomson M, McCarroll J, Bond J, et al. Parathyroid hormone-related peptide modulates signal

圖 1-1 新分離的毛乳頭(100×) 圖 1-2 貼壁 24h 后 DPC(100×)圖 1-3 貼壁 72h 后的 DPC(100×) 圖 1-4 DPC 充分生長(zhǎng)后的狀態(tài)(100×)二、組織內(nèi) mRNA 原位雜交

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2833909