目的:在腫瘤中,MHCⅠ類分子提呈腫瘤相關(guān)抗原TAA給CD8~+T細(xì)胞,在其免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要作用。腫瘤細(xì)胞表面MHCⅠ類分子表達(dá)的下調(diào)甚至缺失是腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸的最重要的原因之一。因此,研究提高腫瘤細(xì)胞表面MHCⅠ類分子表達(dá)的手段及其調(diào)節(jié)機(jī)制,對(duì)于腫瘤的治療具有重要意義。黑素瘤是一種惡性的皮膚腫瘤,因其高度惡性,多發(fā)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后較差而為人所熟知。二甲雙胍(metformin,以下簡(jiǎn)稱Met)作為新發(fā)現(xiàn)的抗癌藥物,能夠抑制黑素瘤細(xì)胞的繁殖、運(yùn)動(dòng)與侵襲。但其抗癌機(jī)制尚不明確,仍需進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)將研究二甲雙胍對(duì)B16F10黑素瘤細(xì)胞表面MHCⅠ類分子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,并通過ERK信號(hào)通路激活劑佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)的反證,來驗(yàn)證該調(diào)節(jié)依賴于二甲雙胍對(duì)ERK信號(hào)通路的抑制。研究結(jié)果將為MHCⅠ類分子表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制提供新依據(jù),為二甲雙胍的抗癌機(jī)制提供新思路。方法:1細(xì)胞來源:本實(shí)驗(yàn)使用的小鼠B16F10(H-2~b)黑素瘤細(xì)胞來源于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。2實(shí)驗(yàn)分組與干預(yù):本實(shí)驗(yàn)分為兩階段,第一階段使用二甲雙胍干預(yù)細(xì)胞24h,根據(jù)濃度分為空白對(duì)照組,2.5 mM Met組,5 mM Met組,10mM Met組和20 mM Met組;第二階段使用二甲雙胍和/或PMA干預(yù)細(xì)胞24h,因PMA需溶于二甲基亞砜(DMSO)后方能在培養(yǎng)基中溶解,為排除DMSO的影響,所以此階段分組中均含1%DMSO。根據(jù)干預(yù)藥物種類和濃度分為空白對(duì)照組(1%DMSO組),10 mM Met+1%DMSO組,20 mM Met+1%DMSO組(僅蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中含),0.125μM PMA組,10 mM Met+0.125μM PMA組。3采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量?jī)呻A段各組中B16F10細(xì)胞表面H-2D~b和H-2K~b(B16F10(H-2~b)細(xì)胞表面最重要的兩種MHCⅠ類分子)的表達(dá)量。4采用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR)技術(shù)檢測(cè)兩階段各組中B16F10細(xì)胞內(nèi)H-2D~b和H-2K~b的基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。5采用蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot)技術(shù)測(cè)量B16F10細(xì)胞內(nèi)ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表達(dá)量。6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析并以?x±s表示計(jì)量資料,采用單因素方差分析,用用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行組間的兩兩比較,檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。結(jié)果:1.二甲雙胍能夠抑制B16F10細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2的蛋白質(zhì)表達(dá),對(duì)ERK1/2的蛋白質(zhì)表達(dá)無影響Western blot結(jié)果顯示,經(jīng)等比濃度的二甲雙胍(2.5,5,10,20 mM)處理24h后,與空白對(duì)照組相比,B16F10細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量(of control)呈先降低后升高的變化趨勢(shì)。經(jīng)單因素方差分析,P0.01,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)SNK-q檢驗(yàn),組間兩兩比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。可見,二甲雙胍可以抑制B16F10細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2的蛋白質(zhì)表達(dá),且最適濃度出現(xiàn)在10 mM左右。經(jīng)過24h的相同處理,與空白對(duì)照組相比,各實(shí)驗(yàn)組B16F10細(xì)胞內(nèi)ERK1/2的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量(of control)無明顯變化,P0.05,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可見,二甲雙胍對(duì)B16F10細(xì)胞內(nèi)ERK1/2的蛋白質(zhì)表達(dá)無影響。2.PMA提高B16F10細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2的蛋白質(zhì)表達(dá),對(duì)ERK1/2的蛋白質(zhì)表達(dá)無影響Western blot結(jié)果顯示,經(jīng)0.125μM PMA處理24h后,與空白對(duì)照組(1%DMSO組)相比,B16F10細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量(of control)明顯升高。經(jīng)SNK-q檢驗(yàn),P0.05,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可見,PMA提高B16F10細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2的蛋白質(zhì)表達(dá)。經(jīng)相同處理24h后,與空白對(duì)照組(1%DMSO組)相比,實(shí)驗(yàn)組B16F10細(xì)胞內(nèi)ERK1/2的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量(of control)無明顯變化,兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)�？梢�,PMA對(duì)B16F10細(xì)胞內(nèi)ERK1/2的蛋白質(zhì)表達(dá)無影響。3.二甲雙胍抑制經(jīng)PMA上調(diào)的B16F10細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2的蛋白質(zhì)表達(dá),對(duì)ERK1/2的蛋白質(zhì)表達(dá)無影響Western blot結(jié)果顯示,經(jīng)10 mM Met+1%DMSO和20 mM Met+1%DMSO處理24h后,與空白對(duì)照組(1%DMSO組)相比,B16F10細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量(of control)明顯降低,P0.05,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但兩實(shí)驗(yàn)組間差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)�？梢�,當(dāng)1%DMSO存在時(shí),二甲雙胍仍可抑制B16F10細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2的蛋白質(zhì)表達(dá),但不同濃度間的抑制作用差異可能有所變化。此時(shí),B16F10細(xì)胞內(nèi)ERK1/2的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量(of control)無明顯變化,兩實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。可見,當(dāng)1%DMSO存在時(shí),二甲雙胍對(duì)B16F10細(xì)胞內(nèi)ERK1/2的蛋白質(zhì)表達(dá)無影響。經(jīng)10 mM Met+0.125μM PMA處理24h后,與0.125μM PMA組相比,B16F10細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量(of control)明顯降低,P0.05,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義�？梢�,二甲雙胍能夠抑制經(jīng)PMA上調(diào)的B16F10細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2的蛋白質(zhì)表達(dá)。此時(shí),B16F10細(xì)胞內(nèi)ERK1/2的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量(of control)無明顯變化,兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。可見,二甲雙胍對(duì)PMA處理后的B16F10細(xì)胞內(nèi)ERK1/2的蛋白質(zhì)表達(dá)并無影響。4.二甲雙胍上調(diào)B16F10細(xì)胞表面H-2D~b和H-2K~b的表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,經(jīng)等比濃度的二甲雙胍(2.5,5,10,20 mM)處理24h后,與空白對(duì)照組相比,H-2D~b和H-2K~b陽(yáng)性的細(xì)胞比例均呈峰樣變化。經(jīng)單因素方差分析,P0.01,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)SNK-q檢驗(yàn),組間兩兩比較,除空白對(duì)照組與2.5 mM Met組的細(xì)胞表面H-2K~b的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P0.05),其它組間兩兩比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)�？梢�,二甲雙胍能夠上調(diào)B16F10細(xì)胞表面H-2D~b和H-2K~b的表達(dá),且最適濃度出現(xiàn)在10 mM左右。5.PMA降低B16F10細(xì)胞表面H-2D~b和H-2K~b的表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,經(jīng)0.125μM PMA處理24h后,與空白對(duì)照組(1%DMSO組)相比,H-2D~b和H-2K~b陽(yáng)性的細(xì)胞比例均降低。經(jīng)SNK-q檢驗(yàn),P0.05,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義�？梢�,PMA降低B16F10細(xì)胞表面H-2D~b和H-2K~b的表達(dá)。6.二甲雙胍上調(diào)經(jīng)PMA抑制的B16F10細(xì)胞表面H-2D~b和H-2K~b的表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,經(jīng)10 mM Met+1%DMSO處理24h后,與空白對(duì)照組(1%DMSO組)相比,B16F10細(xì)胞表面H-2D~b和H-2K~b的表達(dá)均明顯升高,P0.05,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可見,當(dāng)1%DMSO存在時(shí),二甲雙胍仍可提高B16F10細(xì)胞表面H-2D~b和H-2K~b的表達(dá)。經(jīng)10 mM Met+0.125μM PMA處理24h后,與0.125μM PMA組相比,H-2D~b和H-2K~b陽(yáng)性的細(xì)胞比例均升高,P0.05,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義�？梢�,二甲雙胍能夠上調(diào)經(jīng)PMA抑制的B16F10細(xì)胞表面H-2D~b和H-2K~b的表達(dá)。7.二甲雙胍上調(diào)B16F10細(xì)胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達(dá)RT-qPCR結(jié)果顯示,經(jīng)二甲雙胍(5,10,20 mM)處理24h后,與空白對(duì)照組相比,B16F10細(xì)胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達(dá)均升高,P0.05,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。空白對(duì)照組與2.5 mM Met組之間,10 mM Met與20 mM Met組之間,B16F10細(xì)胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。可見,二甲雙胍能夠上調(diào)B16F10細(xì)胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達(dá)。8.PMA降低B16F10細(xì)胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達(dá)RT-qPCR結(jié)果顯示,經(jīng)0.125μM PMA處理24h后,與空白對(duì)照組(1%DMSO組)相比,B16F10細(xì)胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達(dá)均降低,P0.05,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義�？梢�,PMA能夠降低B16F10細(xì)胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達(dá)9.二甲雙胍上調(diào)經(jīng)PMA抑制的B16F10細(xì)胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達(dá)RT-qPCR結(jié)果顯示,經(jīng)10 mM Met+1%DMSO處理24h后,與空白對(duì)照組(1%DMSO組)相比,B16F10細(xì)胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達(dá)均明顯升高,P0.05,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義�？梢�,當(dāng)1%DMSO存在時(shí),二甲雙胍仍可提高B16F10細(xì)胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達(dá)。經(jīng)10 mM Met+0.125μM PMA處理24h后,與0.125μM PMA組相比,B16F10細(xì)胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達(dá)均升高,P0.05,組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可見,二甲雙胍能夠上調(diào)經(jīng)PMA抑制的B16F10細(xì)胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達(dá)。結(jié)論:1.ERK信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)B16F10細(xì)胞MHCⅠ類分子的表達(dá)。2.二甲雙胍通過抑制ERK信號(hào)通路上調(diào)B16F10黑素瘤細(xì)胞表面MHCⅠ類分子的表達(dá)。
【學(xué)位單位】：承德醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R739.5
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
英文縮寫
前言
材料與方法
結(jié)果
附圖
討論
結(jié)論
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綜述
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