發(fā)布時(shí)間：2020-09-28 14:29

　　 黑素瘤是常見(jiàn)惡性腫瘤之一,但往往發(fā)現(xiàn)較晚且病情發(fā)展迅速�；熓且环N重要的腫瘤治療方法,通常作為手術(shù)后的輔助治療、腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)治療和不能手術(shù)切除治療的重要手段之一�；熕幬餁[瘤細(xì)胞主要是通過(guò)促進(jìn)其發(fā)生凋亡而起到治療腫瘤的目的。然而,在化療過(guò)程中腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的凋亡具有抵抗能力,某些腫瘤甚至可在化療后出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象,嚴(yán)重影響了化療效果。顯然化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時(shí)激活了腫瘤細(xì)胞內(nèi)的一系列生物信號(hào),在內(nèi)、外生物信號(hào)和藥物誘導(dǎo)凋亡之間存在著平衡,促進(jìn)和抑制凋亡因素之間的相互作用決定了細(xì)胞的存亡 核轉(zhuǎn)錄因子-KB(nuclear factor-KB, NF-κB)是一類(lèi)廣泛分布于真核細(xì)胞中、作用多樣的轉(zhuǎn)錄因子,在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成中起著關(guān)鍵作用。近年來(lái)有報(bào)道認(rèn)為腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥與NF-KB關(guān)系密切。NF-KB能被多種因素所激活,其中包括促炎細(xì)胞因子、細(xì)胞應(yīng)激以及生長(zhǎng)因子等；它也能被化療藥物激活,包括柔紅霉素、阿霉素以及順鉑等化療藥物。NF-κB也是凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,它可以誘導(dǎo)某些抗凋亡因子的表達(dá),如Survivin和Bcl-2,抑制細(xì)胞凋亡。NF-KB的激活受到NF-KB抑制劑(inhibitor of NF-κB, IκB)的嚴(yán)格調(diào)控,所以,在傳統(tǒng)化療藥物治療的同時(shí)給予NF-KB抑制劑,可能通過(guò)阻斷NF-κB通路和抑制相關(guān)蛋白的表達(dá),降低腫瘤局部復(fù)發(fā)和提高患者的生存率。 吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)是一種小分子毓基化合物,它具有多種生化活性,如改變氧化還原狀態(tài)、重金屬的螯合及抑制酶的作用。PDTC最初被作為一種抗氧化劑應(yīng)用,它既能抵抗自由基的毒性作用,也能干擾促炎細(xì)胞因子的生成,現(xiàn)已被用作NF-KB的強(qiáng)效抑制劑。目前已發(fā)現(xiàn)PDTC可以促進(jìn)多種體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的凋亡,抑制其增殖,并可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療及放療的敏感性。關(guān)于PDTC對(duì)黑素瘤細(xì)胞的作用,國(guó)內(nèi)外尚無(wú)研究。因此,本課題通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),研究PDTC對(duì)黑素瘤B16細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的影響,并研究PDTC對(duì)腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的作用。 目的：研究NF-KB特異性抑制劑PDTC對(duì)鼠黑素瘤B16細(xì)胞增殖及凋亡的影響；并測(cè)定其對(duì)VEGF表達(dá)的影響,了解PDTC體外抗黑色素瘤作用及其機(jī)制,為PDTC治療黑色素瘤提供重要的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)和理論依據(jù)。 方法：以不同濃度的PDTC (25、50、100μmol/L)作用于鼠黑素瘤B16細(xì)胞不同時(shí)間(12、24、36h)后： (1)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化； (2)四甲基噻唑氮藍(lán)(MTT)法測(cè)定其對(duì)B16細(xì)胞增殖的抑制率； (3)比色法檢測(cè)Caspase-3活性變化； (4)免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、 Bcl-2和Survivin的表達(dá)； (5) ELISA檢測(cè)PDTC作用下B16細(xì)胞VEGF的表達(dá)情況。 結(jié)果：(1)倒置顯微鏡下,對(duì)照組細(xì)胞緊貼瓶底,細(xì)胞生長(zhǎng)活躍,呈梭狀,有較長(zhǎng)偽足；加入PDTC后培養(yǎng)的B16細(xì)胞形態(tài)逐漸變圓,而典型的呈梭狀生長(zhǎng)細(xì)胞減少,與鄰近細(xì)胞接觸減少,并有大量細(xì)胞呈漂浮狀態(tài)； (2)MTT法顯示,不同濃度PDTC (25、50、100μmol/L)作用B16細(xì)胞不同時(shí)間(12、24、36h)后,能夠顯著抑制B16細(xì)胞的增殖,且呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴(lài)性,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間比較差異有顯著性(P0.01)； (3)比色法檢測(cè)顯示,隨著藥物濃度加大,Caspase-3活性增加,與對(duì)照組比較差異有顯著性(P0.01),且高濃度組比低濃度組活性增高,其差異也有顯著性(P0.01)； (4)免疫組化法顯示,PDTC作用24h后細(xì)胞中PCNA、 Bcl-2、 Survivin表達(dá)均下調(diào),與對(duì)照組比較差異有顯著性(P0.01)； (5) ELISA法顯示,PDTC作用24h后B16細(xì)胞VEGF表達(dá)降低,與對(duì)照組比較差異有顯著性(P0.01),且呈明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系。 結(jié)論：(1)PDTC能抑制鼠黑素瘤B16細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,存在時(shí)間和劑量依賴(lài)性； (2) PDTC能誘導(dǎo)鼠黑素瘤B16細(xì)胞凋亡,其治療腫瘤機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-κB活性并下調(diào)PCNA、 Bcl-2和Survivin表達(dá),促進(jìn)Caspase-3活化而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡； (3) PDTC能有效降低鼠黑素瘤B16細(xì)胞VEGF的分泌； (4) PDTC有望為黑色素瘤化學(xué)預(yù)防和化學(xué)輔助治療帶來(lái)新的前景。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類(lèi)】：R739.5
【文章目錄】：
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中文摘要
Abstract
1 前言
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
    2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
3 結(jié)果
    3.1 倒置顯微鏡觀察B16細(xì)胞生長(zhǎng)情況
    3.2 MTT法檢測(cè)不同濃度PDTC對(duì)B16細(xì)胞增殖的影響
    3.3 PDTC對(duì)黑素瘤B16細(xì)胞Caspase-3活性的影響
    3.4 PDTC對(duì)黑素瘤B16細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)的影響
    3.5 PDTC對(duì)黑素瘤B16細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的影響
    3.6 PDTC對(duì)黑素瘤B16細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)的影響
    3.7 PDTC對(duì)黑素瘤B16細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF蛋白表達(dá)的影響
4 討論
    4.1 PDTC對(duì)黑素瘤B16細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的抑制作用
    4.2 PDTC誘導(dǎo)黑素瘤B16細(xì)胞調(diào)亡
    4.3 PDTC抑制黑素瘤B16細(xì)胞VEGFe蠓置

本文編號(hào)：2828904