背景:銀屑病作為一種慢性免疫相關的炎癥性疾病,其病因病機不清,迄今尚無滿意療法。近年發(fā)現(xiàn),干細胞具有免疫調(diào)劑作用,有望治愈銀屑病。源于真皮的干細胞即皮膚前體細胞(skin-derived precursors,SKPs)易于取材、來源豐富、無異源性干擾,可成為銀屑病干細胞移植的重要來源。而目前關于SKPs對銀屑病的治療尚未見報道。目的:通過構(gòu)建體外銀屑病三維皮膚模型,移植SKPs至銀屑病模型,應用組織學、分子生物學等方法觀察銀屑病模型移植前后皮膚組織細胞、炎癥因子及基因表達的變化,以探討SKPs對銀屑病的治療作用及機制,為進一步體內(nèi)研究SKPs治療銀屑病提供實驗依據(jù)。方法:1.構(gòu)建體外銀屑病三維皮膚模型:(1)SKPs、角質(zhì)形成細胞(keratinocytes,KC)、成纖維細胞(fibroblasts,FBs)的分離和培養(yǎng):取新生BALB/c小鼠,分離表皮和真皮,真皮分離的細胞培養(yǎng)SKPs、FBs;兒童包皮的表皮分離的細胞懸液培養(yǎng)KC。(2)正常三維皮膚模型的構(gòu)建及鑒定:將獲取的FBs與Ⅰ型鼠尾膠原混合建立三維皮膚真皮結(jié)構(gòu),然后在其表面接種KC,行氣-液界面培養(yǎng)以構(gòu)建正常三維皮膚模型。采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察皮膚結(jié)構(gòu)和免疫組化染色顯示表皮KC特異性抗體CK10及真皮FBs特異性抗體VIM表達情況。(3)銀屑病三維皮膚模型的構(gòu)建:在構(gòu)建正常三維皮膚模型的KC培養(yǎng)基中加入腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)構(gòu)建銀屑病三維皮膚模型,HE染色觀察銀屑病三維皮膚組織病理學變化。2.SKPs治療銀屑病三維皮膚:(1)實驗分組:將成功構(gòu)建的三維皮膚隨機分為4組:正常組、模型組、治療組和對照組。(2)SKPs移植到銀屑病三維皮膚:將紅色熒光PKH26標記的SKPs移植到治療組,對照組注射Hanks液。(3)標本收集:分別收集正常組、模型組造模第3、6、9、12天以及治療組和對照組治療后第3、6天的上清液。同時收集上述4組造模或治療后6天的皮膚組織。HE染色觀察皮膚組織病理學變化。(4)指標檢測:采用ELISA法檢測各組上清液中的IL-1、IL-12、IL-17濃度以及qPCR檢測各組組織IL-1a、IL-12a、IL-17a mRNA表達水平。3.采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料以均數(shù)±標準差((?)±s)表示,采用t檢驗。P0.05差異有統(tǒng)計學意義。采用Graphpad Prism 6軟件分析數(shù)據(jù)繪圖。結(jié)果:1.原代分離培養(yǎng)的KC和FBs在鏡下為貼壁生長,KC呈鋪路石樣或卵石樣形態(tài),FBs呈多角形或菱形外觀;SKPs為懸浮生長,呈圓形或球形克隆樣細胞團,細胞球中央顏色較深,周圍明亮。2.三維皮膚模型外觀表現(xiàn):(1)正常三維皮膚表現(xiàn)為白色半透明狀,邊緣整齊無卷曲;(2)銀屑病三維皮膚呈乳白色不透明,邊緣卷曲,較正常三維皮膚縮小變厚。3.三維皮膚模型病理組織學改變及鑒定:(1)HE染色下,正常三維皮膚由表皮層和真皮層組成,分界清楚;表皮層細胞排列較整齊、形態(tài)一致;真皮層由少量細胞和膠原構(gòu)成,結(jié)構(gòu)緊密。(2)銀屑病三維皮膚表皮明顯增厚。(3)免疫組化染色顯示正常三維皮膚表皮細胞著棕黃色、表達CK10陽性即為KC;真皮層著深棕黃色、表達VIM陽性即為FBs,正常三維皮膚模型成功構(gòu)建。4.SKPs移植到銀屑病三維皮膚后其冰凍切片顯示攜帶紅色熒光的SKPs彌散分布于皮膚組織中,并在組織中存活良好。5.SKPs對銀屑病三維皮膚的作用:(1)經(jīng)SKPs移植治療后治療組三維皮膚表皮及棘層明顯變薄;而對照組則改善不明顯。(2)各組上清經(jīng)ELISA檢測后,模型組IL-1、IL-12、IL-17表達水平較正常組明顯升高(P㩳0.05);但經(jīng)SKPs移植后,IL-1、IL-12和IL-17表達水平較模型組及對照組均明顯降低(P㩳0.05);對照組與模型組比較,IL-1、IL-12和IL-17水平降低不明顯(P0.05)。(3)各組皮膚組織經(jīng)基因檢測后,模型組表達IL-1a、IL-12a、IL-17a mRNA水平較正常組顯著升高(P㩳0.05);然而經(jīng)SKPs移植后,治療組IL-1a、IL-12a、IL-17a mRNA表達均較模型組和對照組明顯降低(P㩳0.05);對照組與模型組比較,IL-1a、IL-12a、IL-17a mRNA水平無顯著降低(P0.05)。結(jié)論:1.體外培養(yǎng)的KC、FBs可與Ⅰ型鼠尾膠原成功構(gòu)建正常三維皮膚模型。2.在正常三維皮膚基礎上,持續(xù)加入TNF-α和IFN-γ,可成功建立銀屑病三維皮膚模型,為銀屑病發(fā)病機制及治療研究提供良好實驗載體。3.將SKPs移植到銀屑病三維皮膚,可減輕表皮厚度,降低炎癥因子IL-1、IL-12、IL-17表達,從而起到緩解銀屑病的作用。
【學位單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R758.63
【部分圖文】：

SKPs (×100) SKPs (×400)圖 1 原代培養(yǎng)的 SKPs 懸浮生長，呈圓形或球形克隆樣細胞團。re2 The cultured SKPs were in a suspended growth by a round or pelletized clonKC (×100) KC (×400)圖 2 培養(yǎng)的 KC 貼壁生長，細胞呈鋪路石樣或卵石樣形態(tài)。ure2 The cultured KC grew stick to cells wall in the culture medium with paving

SKPs (×100) SKPs (×400)圖 1 原代培養(yǎng)的 SKPs 懸浮生長，呈圓形或球形克隆樣細胞團。re2 The cultured SKPs were in a suspended growth by a round or pelletized clon

FBs (×100) FBs (×400)圖 3 原代培養(yǎng)的 FBs 貼壁生長，細胞呈長梭形及多角形。re3 The primary cultured FBs grew stick to cells wall in the culture medium witspindle or ploygan shape.外三維皮膚的外觀、組織病理學及特性正常三維皮膚和銀屑病三維皮膚外觀 正常三維皮膚肉眼表現(xiàn)正常三維皮膚構(gòu)建初，皮膚模型均勻透明，邊緣整齊無卷曲（圖培養(yǎng)至第 7 天，皮膚模型整體縮小，呈白色半透明狀，邊緣整齊卷曲，皮膚較初期變厚（圖 4B）。 銀屑病三維皮膚肉眼表現(xiàn)

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本文編號：2827865