目的探討c-Jun氨基末端激酶1(JNK1)或JNK2過表達對人皮膚鱗狀細胞癌細胞SCL-1增殖和凋亡的影響及分子機制。方法將JNK1、JNK2分別與pHBAD-EF1-MCS-3flag-CMV-GFP載體結合,構建JNK1和JNK2的重組腺病毒表達載體,轉染SCL-1細胞,優(yōu)化轉染條件,實時熒光定量PCR技術(qPCR)和Western Blot技術鑒定過表達效果;CCK-8(cell counting kit-8)法測定SCL-1細胞的增殖活性,細胞克隆形成實驗反應細胞集落形成能力;細胞劃痕實驗檢測細胞融合率;流式細胞術檢測細胞凋亡水平;qPCR檢測JNK1、JNK2、c-Jun mRNA相對表達水平;Western blot法檢測磷酸化c-Jun的蛋白表達水平。結果成功構建JNK1/JNK2過表達腺病毒載體;JNK1、JNK2過表達腺病毒載體最佳轉染條件為MOI=100,轉染48h;轉染后,SCL-1細胞的JNK1和JNK2的表達水平顯著升高(P0.05);與對照組相比,Ad-JNK1組細胞增殖和抗凋亡能力無顯著影響(P0.05),Ad-JNK2組細胞增殖和抗凋亡能力明顯增強(P0.05);JNK效應蛋白c-Jun磷酸化蛋白表達水平上調。結論過表達JNK2可以增強SCL-1人皮膚鱗狀細胞癌細胞的增殖能力和抗凋亡能力。
【學位單位】：寧夏醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R739.5
【部分圖文】：

學碩士學位論文 清液，加入按 DMSO：FBS=1：9 比例配置的凍存液 1 mL，輕輕吹液裝入凍存管中，標記細胞名稱、凍存時間及操作者的姓名；存管放置 4℃冰箱中 20 min~30 min，隨后放入-20℃冰箱中 90 min0℃冰箱中過夜，第二天放入液氮罐中，長期保存。、JNK2 腺病毒過表達載體的構建重組技術，將 JNK1、JNK2 分別插入 pHBAD-EF1-MCS-3flag-CMV1 和 JNK2 序列均為人源 mRNA 序列（human JNK1；human JNK2）和目的基因信息

寧夏醫(yī)科大學碩士學位論文 集脫落細胞懸液，用離心機，2000 rpm，離心 5 min，吸去上清液，加入 6 m培養(yǎng)基+10%FBS+2.5%甘油）的 ST buffer，渦旋震蕩混勻，凍融 3 次，用離心rpm 離心 5 min,收集上清液（P3）�！�7 JNK1/JNK2 腺病毒感染性滴度檢測用改進的病毒半數(shù)組織細胞感染量（5culture infective dose，TCID50）法。TCID50 法步驟如下：a 取細胞融合至 80%~90%的 293 細胞，吸去舊培養(yǎng)基，加入 PBS 溶液沖洗細胞消化細胞，按照每孔 1×105個細胞接種于兩塊 96 孔板中；b 對 JNK1/JNK2 重組腺病毒樣品按梯度稀釋，按下圖在 96 孔板中加入稀釋樣

寧夏醫(yī)科大學碩士學位論文 結果結果1 成功構建JNK1和JNK2基因過表達質粒并包裝入腺病毒1.1構建質粒后，漢恒生物科技（上海）公司測序結果與目的序列完全匹配，驗證JNK1/JNK2目的片段已克隆入載體中（圖3、圖4）

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本文編號：2820572