背景和目的：蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化在細胞的生命活動中起著重要的作用。蛋白磷酸酶2A (PP2A)是生物體內(nèi)主要的絲/蘇氨酸磷酸酶,參與了細胞代謝、DNA復(fù)制、細胞周期和細胞分化等生命活動。研究顯示,PP2A也參與了皮膚細胞的增殖分化和創(chuàng)傷愈合。本研究擬通過在皮膚角質(zhì)細胞中特異性敲除PP2A蛋白C亞基(Ppp2ca)基因構(gòu)建小鼠模型,探索Ppp2ca在小鼠皮膚生長發(fā)育中的作用。 方法：將Kre14-Cre轉(zhuǎn)基因工具鼠和Ppp2ca條件型敲除小鼠通過兩代的交配,得到從胚胎期14.5天開始在角質(zhì)細胞中缺失Ppp2ca基因的小鼠。通過對不同時期小鼠皮膚組織的Western、皮膚組織切片、免疫組化等實驗,分析缺失Ppp2ca對小鼠皮膚生長發(fā)育的影響。 結(jié)果：首先獲得了基因型為Ppp2cαflox/flox; Krt14-Cre的小鼠,并通過皮膚基因組PCR鑒定及Western Blotting等方法驗證了Ppp2ca基因在這種突變小鼠皮膚組織中的表達降低。在皮膚角質(zhì)形成細胞中特異性敲除Ppp2ca,敲除鼠體重明顯變小、毛發(fā)稀少并且腳掌出現(xiàn)色素沉著,30%敲除鼠在出生后6W內(nèi)死亡；對出生后P5(follicular morphogenesis)、P11(anagen)、P17(catagen)、 P24(telogen)以及P32(anagen)天小鼠皮膚組織進行形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),敲除鼠在出生后第一個毛發(fā)生長周期毛囊形態(tài)發(fā)育異常,毛囊排列紊亂,不能正常下沉到脂肪細胞層,導(dǎo)致毛發(fā)生長受阻滯。皮膚毛囊分化標(biāo)志性蛋白AE13與AE15在敲除鼠中表達下降,表明敲除鼠毛干皮層角蛋白表達量減少,毛囊髓質(zhì)和IRS層的毛透明蛋白表達減少,提示毛囊分化異常。 結(jié)論：本研究證實了在皮膚角質(zhì)形成細胞中敲除Ppp2ca基因會導(dǎo)致小鼠發(fā)育受阻,體型變小,腳掌出現(xiàn)色素沉著,皮膚毛囊分化發(fā)育異常及小鼠皮膚毛發(fā)稀疏。推測Ppp2ca參與了皮膚毛囊分化信號通路,是皮膚生發(fā)所需基因。
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：Q78;R751
【部分圖文】：

^mi=322圖2 ?Pp/jJca條件型敲除小鼠構(gòu)建示意圖。A: Ppp2ca含有309AA氨基酸序列。催化亞基C (淡黃色區(qū)域）占23-305AA，本實驗室敲除C亞基的35-105AA (深黃色區(qū)域）。B: Pppica載體構(gòu)建示意圖。C: Pppica引物鑒定示意圖（其中1，2，3泳道的基因型分別為WT, Ppp2ca伽‘加,Ppp2ca''^°~', M 為 Marker)。為了驗證Ppp2ca是否與皮膚生長發(fā)育密切相關(guān)，本實驗使用Krtl4-Cre工具鼠阻斷Ppp2ca在皮膚角質(zhì)形成細胞中的表達。Krtl4-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠由人源的Krtl4啟動子啟動Cre重組酶的表達，表達始于小鼠胚胎期14.5天的表皮毛發(fā)和頸須毛囊細胞，成年小鼠的表皮和毛囊中也有強烈的Cre酶表達。部分Krtl4_Cre雌性小鼠卵母細胞中也有Cre酶表達，為了避免產(chǎn)生敲除的配子，所以不能用Krtl4-Cre雌鼠交配。將雄性的Krtl4-Cre小鼠與/?？““雌鼠交配

A: P/;p2a/""’&//ACre小鼠組織基因組PCR，1，2，3號泳道分別為胸腺，舌，皮膚組織基因組DNA。B: Ppp2ccf"、}0;Krtl4-Cre小鼠皮膚中Ppp2ca蛋白表達情況。C:不同基因小鼠皮膚cDNA的PCR電泳結(jié)果，1,2,3號泳道小鼠基因型分別為Ppp2ca?"to. f^,.fj4.Cre, Ppp2ca ""' ； KriN-Cre , WT, M 為 Maker。D: Ppp2ccJi'—、’ Krtl4-Cre小鼠與對照鼠皮膚切片免疫組化實驗(400倍放大)。3、Pppica的缺失對小鼠生長發(fā)育的影響在成功得到實驗所需基因型的小鼠后，我們發(fā)現(xiàn)這種小鼠體型均比同窩對照小（圖4A)且表現(xiàn)為不同程度的毛發(fā)稀疏（圖4B-C),出生后一周內(nèi)小鼠腳掌出現(xiàn)肉眼可見的色素沉著（圖4D)，敲除鼠尾巴變硬成竹節(jié)狀（圖4E-G),30%的小鼠在出生后4-6W內(nèi)死亡。

本實驗將處于毛囊分化不同時期的小鼠皮膚切片進行免疫組化染色，使用的抗體為AE13和AE15。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除鼠AE13染色明顯低于對照組（圖6)。AE15染色在P5天時無明顯變化，但是從P11天毛囊發(fā)育異常開始染色明顯降低，在部分毛囊中甚至消失了（圖7)。這些結(jié)果表明，敲除鼠角化的皮質(zhì)層減少并且毛干髓質(zhì)和IRS層分化異常。推測可能是由于IRS層和毛干髓質(zhì)的分化受阻導(dǎo)致毛發(fā)生長周期被擾亂。Control Mutant? ?? % ‘ ~'z ^ \、\、D、■‘P"截、、：■”P17F'、“’圖6毛發(fā)生長不同時期敲除鼠與對照壀皮膚的AE13免疫組化實驗（褐色表示AE13陽性細胞）（200倍放大）32

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2 ;用于小鼠皮膚損傷深入評價的非應(yīng)激性保定裝置[J];上海實驗動物科學(xué);1997年03期

3 王建文,王宗惠,高居忠,管德林,許建軍,夏成青;供體特異性輸注對異基因小鼠皮膚移植的影響[J];首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2000年04期

4 肖鄭穎;吳淑蓮;李暉;;基于光學(xué)相干層析成像技術(shù)的小鼠表皮厚度的無損測量及分析[J];激光生物學(xué)報;2009年06期

5 朱奎成;章金濤;王純耀;杜春燕;邢金山;;豫醫(yī)無毛小鼠皮膚透射電鏡觀察[J];四川動物;2011年02期

6 張豐,李青,趙一嶺,王淑芳,洪柳,聶蕾,張麗英;小鼠皮膚干細胞染色體非隨機分配方式的研究[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報;2005年09期

7 朱孝榮;胡安康;彭長凌;朱裕華;劉學(xué);;小鼠皮膚快速冷凍:體外長期保存的方法[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2007年02期

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本文編號：2812393