【摘要】：目的 研究惡性黑色素瘤細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)間的相互作用及作用機(jī)制,從而進(jìn)一步明確惡性黑色素瘤血管形成機(jī)制中內(nèi)皮細(xì)胞來源和惡性黑色素瘤細(xì)胞多種因子表達(dá)情況及間充質(zhì)干細(xì)胞對其表達(dá)的影響,豐富腫瘤局部微循環(huán)建立模式的相關(guān)理論,并為惡性黑色素瘤中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)自分泌機(jī)制和正反饋環(huán)路的研究提供一定的理論依據(jù)。 方法 通過四肢長骨分離和骨髓腔沖洗得到骨髓,應(yīng)用貼壁篩選等細(xì)胞篩選方法,選取適當(dāng)血清濃度、細(xì)胞接種密度等細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和擴(kuò)增培養(yǎng),通過倒置相差光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞光鏡下形態(tài),并應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法,通過倒置熒光顯微鏡、倒置相差光學(xué)顯微鏡、圖像采集系統(tǒng)觀察并檢測CD44、CD105、CD34和CD45等指標(biāo)的染色結(jié)果進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定。 通過體外進(jìn)行MSC細(xì)胞的單獨(dú)對照培養(yǎng)和與惡性黑色素瘤細(xì)胞(B16細(xì)胞)的非接觸式共培養(yǎng),應(yīng)用倒置相差光學(xué)顯微鏡對比觀察和分析單獨(dú)對照培養(yǎng)和非接觸式共培養(yǎng)條件下的MSC細(xì)胞光鏡下形態(tài),通過激光掃描共聚焦顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、倒置相差光學(xué)顯微鏡、圖像采集系統(tǒng)觀察和檢測CD44、CD105、CD34、CD45、Ⅷ因子、VEGFR-1和VEGFR-2等7種指標(biāo)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果,并對所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以明確兩組間7種指標(biāo)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的差異和觀察透射電鏡下超微結(jié)構(gòu)的變化,以及通過激光掃描共聚焦顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、倒置相差光學(xué)顯微鏡、圖像采集系統(tǒng)觀察和檢測MSC細(xì)胞和與惡性黑色素瘤細(xì)胞(B16細(xì)胞)在非接觸式共培養(yǎng)條件下的惡
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R739.5
【圖文】：

表明CD44強(qiáng)陽性(平均陽性率93.1%)，CD105陽性(陽性率79.2%)，CD34陰性(陽性率4.%7，免疫熒光陰性)，CD45陰性(陽性率6.%2，免疫熒光陰性)，見圖1一3至圖1一8。表1MSC細(xì)胞4種鑒定指標(biāo)表達(dá)情況表表型鑒定平均陽性細(xì)胞數(shù)平均陽性率HIC染色強(qiáng)度++++++~+++一+熒光染色情況未測未測陰性陰性.1%2%7%293.79..463723172519染色指標(biāo)CD44CD105CD34CD45注:平均陽性細(xì)胞數(shù)為每種指標(biāo)在多個樣品中陽性細(xì)胞數(shù)的平均值，取整數(shù);平均陽性率為每種指標(biāo)在多個樣品中陽性細(xì)胞數(shù)占400個觀察細(xì)胞的百分率的平均值。圖1一1MSC鑒定實(shí)驗(yàn)24孔板培養(yǎng)細(xì)胞觀察結(jié)果40X圖1一2MSC鑒定實(shí)驗(yàn)24孔板培養(yǎng)細(xì)胞觀察結(jié)果IO0x

2.3.7凈化潔凈室成套工程(百級無菌室)，北方凈化機(jī)房設(shè)備公司，中國2.3.5Tnarswezl，o.4mu孔徑，o.33emZ表面積，eostar公司，貨號3470一elear，見圖2一1和2一2。圖2一1Trnaswell設(shè)備組件圖2一2Trnaswell中的共培養(yǎng)插件3實(shí)驗(yàn)方法3.1體外環(huán)境B16細(xì)胞對MSC細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用3.1.1MSC細(xì)胞與B16細(xì)胞非接觸式共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)3.1.1.1向MSC細(xì)胞培養(yǎng)瓶和B16細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入.02%5的胰蛋白酶尼DAT液sml，消化細(xì)胞5一7分鐘，以鏡下觀察到少部分細(xì)胞脫落，大部分細(xì)胞形態(tài)變?yōu)閳A形，失去原有梭形型態(tài)，即中止消化。3.1.1.2MSC中加入smla一MEM培養(yǎng)基和B16中加入15mla一MEM培養(yǎng)基，充分吹洗培養(yǎng)瓶壁6一7遍，使消化細(xì)胞脫壁。3.1.1.3將2個培養(yǎng)瓶中液體分別吸取到2個不同的離心管(50m)l中，IO00prm離心10分鐘，棄去上清，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，依細(xì)胞數(shù)量，向離心30

【參考文獻(xiàn)】

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1 郝希山,孫保存,張?jiān)娢?趙秀蘭;雙向分化腫瘤血管生成擬態(tài)的分子機(jī)制初步觀察[J];中華腫瘤雜志;2003年06期

2 李中,張成,謝有梅,陳國俊,劉曉蓉;骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植治療DMD模型鼠的肌組織dystrophin/utrophin表達(dá)[J];中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);2004年03期

本文編號：2800856