【摘要】： 外傷后細菌性致死性肉芽腫(fatal bacteria granuloma after trauma,FBGT)是一種繼發(fā)于面部外傷的慢性感染性致死性疾病,目前已明確其病原菌為痤瘡丙酸桿菌(P.acnes),且已證明從患者皮損內(nèi)分離出的細菌并非高毒力變異株。P.acnes是一種革蘭陽性厭氧桿菌,屬于一種低毒力細胞內(nèi)寄生菌。FBGT患者均在皮損出現(xiàn)1.5至4年后死于由P.acnes導致的腦組織炎癥。小膠質(zhì)細胞(microglia,MG)是宿主顱內(nèi)的重要免疫細胞,它可分泌細胞因子促進顱內(nèi)的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。研究病原菌與宿主顱內(nèi)免疫細胞之間相互作用,可能有助于在一定程度明確FBGT發(fā)病機理,為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。 在本研究中,我們以病原菌與宿主顱內(nèi)免疫細胞—MG之間的相互作用為立足點,并在此基礎(chǔ)上通過MTT法、ELISA法、PCR法、流式細胞術(shù)等 方法,探討宿主的顱內(nèi)免疫細胞-MG在P.acnes入侵后在增長、吞噬以及分泌細胞因子等方面改變,期望明白MG和P.acnes的免疫應(yīng)答模式,以闡明FBGT的部分發(fā)病機制。 1.光鏡和電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化。 2. P.acnes對MG增殖和凋亡的影響以及MG吞噬變化。 FBGT病原菌以不同濃度和不同時間作用于MG ,采用甲基噻唑基四唑(MTT)法檢測細胞活性,觀察P.acnes對MG增殖的影響。流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期,觀察MG被P.acnes刺激后細胞的凋亡情況。 3. P.acnes對MG產(chǎn)生TNF-α、IL-1β的影響 以病原菌株和P.acnes標準菌株及相應(yīng)滅活菌菌懸液,按照不同分組,作用于MG24小時后,用RT-PCR的法、ELISA法比較P.acnes作用MG后,在蛋白水平、mRNA水平上細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β的差別。 結(jié)果: 1.倒置顯微鏡觀察MG傳代后貼壁生長,呈梭形或三角形,排列緊密,核分裂像多;和P.acnes共孵育后,大部分細胞變圓,部分細胞聚集成團,細胞周圍有空暈。電鏡下顯示MG表面有微絨毛,MG胞質(zhì)中溶酶體增多現(xiàn)象,與P.acnes作用18h后,可見MG胞膜內(nèi)陷,包繞吞噬細菌,邊緣清晰。 2.P.acnes對MG增殖和凋亡的影響: MG和P.acnes共孵育,分別持續(xù)8h和16h,發(fā)現(xiàn)其細胞活力受到明顯抑制。實驗組與對照組存在顯著差異,各實驗組(即P.acnes活菌組1、2、3、4組)之間有統(tǒng)計學差異(P0.05),P.acnes對MG活力的抑制呈時間和劑量依賴性,空白組、滅活組與實驗組的MG均出現(xiàn)一定數(shù)目的凋亡細胞,但實驗組與各對照組有顯著性差異(P0.05),各對照組間無顯著性差異。各對照組的MG周期無明顯變化,細胞凋亡率隨著孵育時間的延長而呈上升趨勢。 3. P.acnes對MG產(chǎn)生TNF-α、IL-1β的影響 P.acnes臨床株和標準株均可促進MG產(chǎn)生TNF-α和IL-1β,與空白對照組相比有統(tǒng)計學意義(P0.05)與相應(yīng)的滅活菌對照組差別無統(tǒng)計學意義。 結(jié)論: 1.外傷后細菌性致死性肉芽腫病原菌P.acnes可抑制MG的生長,誘導MG調(diào)亡,可能和患者的病原菌入顱病原菌持續(xù)存在,不被MG所殺滅,與其后導致的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。 2.P.acnes均可促進MG產(chǎn)生TNF-α、IL-1β,提示P.acnes刺激機體早期免疫應(yīng)答,可能在一定程度造成對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫損害。 3.本研究探討了P.acnes和MG的相互作用特點,為深入研究FBGT發(fā)病及致死機制打下一定基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R758.733
【圖文】：

和大腸桿菌共孵育18小時[×200].3.2 電鏡觀察與P.acnes作用18h后，可見MG胞膜內(nèi)陷，包繞吞噬細菌（見圖2-A,B)，細胞質(zhì)內(nèi)可見被溶酶體膜包繞的細菌，邊緣清晰[圖2-C]。-37-A B C圖2：電鏡下觀察MG吞噬P.acnesA:MG 吞噬P.acnes的過程（×20k）; B: MG 吞噬滅活的P.acnes的過程（×5k）; C: P.acnes被吞噬時特有的細菌的結(jié)構(gòu)（×20k）。

倒置顯微鏡觀察:MG傳代后貼壁生長，呈梭形或三角形，排列緊密，核分裂像多；和P.acnes共孵育后，大部分細胞變圓，部分細胞聚集成團，細胞周圍有空暈（圖1-A,B），可見MG吞噬滅活的P.acnes（圖1-C）,可見吞噬的E.coli，（圖1-D）。-36-A B

圖 3 TNF-α、IL-1β 的 RT-PCR 電泳圖 對 MG 產(chǎn)生 TNF-α 和 IL-1β 分泌的影響s作用于MG 24 h時，TNF-α、IL-1β表達量均有明顯增加準株滅活組與空白對照組的差別無統(tǒng)計學意義。標準-α表達量高于臨床株作用的細胞，而標準株刺激MG表床菌株，但無統(tǒng)計學意義。（表3）-45-

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本文編號：2792824