【摘要】：沙眼衣原體泌尿生殖道感染是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外最常見的性傳播疾病,絕大部分患者癥狀隱匿,不易被發(fā)現(xiàn),導(dǎo)致沙眼衣原體在宿主體內(nèi)持續(xù)感染,引起一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥和后遺癥。因沙眼衣原體的小鼠動(dòng)物模型不穩(wěn)定,而鼠衣原體與沙眼衣原體的生物學(xué)性狀相似,感染后引起的病程及臨床癥狀、病理改變等均和沙眼衣原體相同,故本課題以鼠衣原體作為研究菌株,小鼠作為動(dòng)物模型,來(lái)進(jìn)一步研究沙眼衣原體在人類的致病機(jī)制。新近的研究提示衣原體除了能感染泌尿生殖道外還能夠感染胃腸道并且持續(xù)存在,其攜帶的隱蔽性質(zhì)粒可能對(duì)生殖道的致病和慢性纖維化的嚴(yán)重程度有重要影響。然而,衣原體在胃腸道感染定植的機(jī)制及生物學(xué)醫(yī)學(xué)意義仍不清楚,質(zhì)粒在胃腸道衣原體感染中所起的作用也不清楚,各種質(zhì)粒編碼基因在衣原體胃腸道感染中都起著什么作用也不清楚。對(duì)這些問(wèn)題的深入研究和探討,對(duì)闡明衣原體在胃腸道和生殖道感染的相互關(guān)聯(lián)與影響有著重要作用。目的研究衣原體質(zhì)粒及質(zhì)粒編碼基因在衣原體胃腸道感染定植的作用及其對(duì)生殖道致病性的影響。方法構(gòu)建小鼠動(dòng)物模型,C57BL/6J(n=70)和CBA/J(n=35)小鼠,陰道、靜脈、直接胃腸感染接種含有質(zhì)粒和質(zhì)粒缺失的鼠衣原體,間接免疫熒光法檢測(cè)陰道及直腸拭子中脫落細(xì)胞中的排菌量,觀察不同的接種途徑下,含有質(zhì)粒的或者不含質(zhì)粒的鼠衣原體在鼠生殖道和胃腸道的感染傳播情況及入血后的感染情況;感染56天處死老鼠,觀察生殖道的大體和顯微鏡下組織病理,觀察腸道及腸外的組織病理變化;用Wilcoxon rank sum test比較含有質(zhì)粒和不含質(zhì)粒衣原體感染小鼠后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)拭子中病原菌數(shù)量(IFUs),基因拷貝數(shù)及感染率“曲線下面積”,用Fisher’s exact test分析兩組之間致病的嚴(yán)重性。純化實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)構(gòu)建好的不同質(zhì)粒編碼基因缺失的衣原體EBs,CBA/J(n=35)小鼠陰道感染接種及C57BL/6J(n=35)小鼠直接灌胃接種,檢測(cè)陰道及直腸拭子中脫落細(xì)胞的排菌量,感染56天或者63天處死老鼠,觀察生殖道的大體和顯微鏡下組織病理,比較不同質(zhì)粒編碼基因在生殖道的致病性作用及胃腸道衣原體感染與生殖道致病的相關(guān)性,明確這些質(zhì)粒編碼基因在生殖道和胃腸道的感染定植作用。質(zhì)粒編碼基因pgp3缺失的鼠衣原體CM-pgp3S在C57BL/6J(n=20)小鼠宮頸內(nèi)、卵巢囊內(nèi)感染及聯(lián)合胃腸道感染,感染56天后處死小鼠觀察生殖道輸卵管積水的嚴(yán)重程度。在C57BL/6J(n=10)和My D88基因敲除(My D88 KO,n=10)小鼠宮頸內(nèi)和卵巢囊內(nèi)感染接種鼠衣原體,感染后3天及14天處死小鼠,生殖道組織分段勻漿,間接免疫熒光法檢測(cè)各組織中帶菌量,進(jìn)一步證明宮頸及子宮輸卵管結(jié)合部在衣原體上行感染過(guò)程中屏障作用。pgp3作為衣原體致病性的毒力因子,質(zhì)粒編碼基因pgp3缺失的鼠衣原體CM-pgp3S陰道內(nèi)及灌胃感染My D88-/-(n=15)、CRAMP-/-(n=8)基因敲除小鼠,間接免疫熒光法檢測(cè)陰道及直腸拭子中脫落細(xì)胞中的排菌量,觀察這些基因敲除小鼠能否恢復(fù)pgp3缺失的鼠衣原體在胃腸道及生殖道的定植。生殖道及胃腸道組織分段勻漿,間接免疫熒光法檢測(cè)各組織中帶菌量,檢測(cè)衣原體在生殖道及胃腸道的分布情況,進(jìn)一步明確My D88及CRAMP在抗病原微生物感染中的作用。結(jié)果1.含有質(zhì)粒的鼠衣原體能夠從生殖道傳播至胃腸道,并且能夠在胃腸道爆發(fā)性生長(zhǎng),在生殖道引起了嚴(yán)重的輸卵管積水;而質(zhì)粒缺失的鼠衣原體從鼠生殖道傳播到胃腸道顯著延遲并降低,不能像含有質(zhì)粒的衣原體一樣,在胃腸道很容易感染定植,同時(shí)不能引起生殖道輸卵管積水(p0.05)。即使通過(guò)靜脈內(nèi)感染或胃內(nèi)直接感染接種,質(zhì)粒缺失的鼠衣原體也明顯不易或不能定植胃腸道。這些發(fā)現(xiàn)顯示衣原體質(zhì)粒對(duì)衣原體在胃腸道的適應(yīng)和生存有重要作用,同時(shí)也顯示衣原體陰道感染后,衣原體質(zhì)粒在促進(jìn)其在生殖道上行感染的重要作用。2.在鼠衣原體質(zhì)粒編碼基因中,pgp3與pgp4起著主要作用:質(zhì)粒編碼基因pgp3或者pgp4缺失的鼠衣原體不能在胃腸道定植,在生殖道不致病,也不能引起嚴(yán)重的輸卵管積水。質(zhì)粒編碼基因pgp3缺失的鼠衣原體CM-pgp3S卵巢囊內(nèi)感染接種后,同時(shí)與胃腸道給予含有質(zhì)粒的衣原體感染后,增加了CM-pgp3S生殖道的致病性,提示衣原體所造成的生殖道慢性纖維化的致病性,不僅需要病原體上行感染于輸卵管/卵巢造成足夠的破壞,還可能依賴與胃腸道提供給生殖道致病的第二信號(hào),即腸道依賴的致病性。pgp3缺失的鼠衣原體不能在胃腸道定植,也可能與其處于持續(xù)感染狀態(tài)有關(guān)。質(zhì)粒編碼基因pgp5、pgp7、pgp8沒(méi)有顯示出與pgp3和pgp4的重要作用:質(zhì)粒編碼基因pgp5、pgp7、pgp8缺失的鼠衣原體在胃腸道的感染沒(méi)有明顯減弱,與含有質(zhì)粒的鼠衣原體類似,相對(duì)應(yīng)的它們?cè)谏车赖闹虏⌒酝鼈冊(cè)谖改c道感染能力強(qiáng)弱一致。3.鼠衣原體在My D88基因敲除小鼠無(wú)論是生殖道還是胃腸道的感染都是增強(qiáng)的,即使是pgp3缺失的鼠衣原體在胃腸道定植和生殖道的感染也是增加的。My D88的作用是維持宮頸及子宮輸卵管結(jié)合部正常屏障作用,由此證實(shí)了固有免疫在宿主防御衣原體入侵的作用,宮頸及子宮輸卵管結(jié)合部屏障作用降低了衣原體在生殖道的上行感染。結(jié)論衣原體攜帶的隱蔽性質(zhì)粒在衣原體胃腸道的定植中有重要作用,甚至比在生殖道更重要,不僅能促進(jìn)在生殖道的致病性,而且通過(guò)定植產(chǎn)生的病理性免疫促使衣原體生殖道感染所致的慢性纖維化。其中pgp3是衣原體質(zhì)粒編碼基因最重要的毒力因子,不僅在衣原體胃腸道的感染定植和生殖道的致病上有重要作用,而且可破壞My D88所起到的天然屏障作用進(jìn)而使得衣原體在生殖道上行感染,并且能夠在胃腸道定植,從另一個(gè)層面也反映了腸道微環(huán)境對(duì)機(jī)體的重要作用。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R759
【圖文】：

使越來(lái)越多的科研工作者投身于其致病機(jī)制、新藥研發(fā)及疫苗研制等的研究中。由于Ct與普通的病毒和細(xì)菌不同，在宿主細(xì)胞內(nèi)繁殖有獨(dú)特的兩相生長(zhǎng)周期（圖1），其中原體(Elementary Body ,EB)無(wú)代謝活性但具有傳染性；網(wǎng)狀體(Reticulate Body ,RB）或稱始體代謝活躍，以二分裂方式進(jìn)行繁殖，無(wú)傳染性，這些特殊的生物學(xué)特性使得抗生素的治療效果并不令人滿意，其治療失敗的機(jī)制至今尚未研究清楚。很多研究團(tuán)隊(duì)把精力投入到了Ct預(yù)防性和治療性疫苗的研制當(dāng)中，包括蛋白疫苗、多肽疫苗、亞單位疫苗，甚至DNA疫苗，但迄今為止尚未研制出具有有效免疫保護(hù)作用的疫苗。

圖2：經(jīng)陰道感染 luciferase-expressing 鼠衣原體后體內(nèi)體外成像及各組織器官的衣原體分布（Qizhang,et al.Infection and immunity,2015）課題組研究(圖2)[27]發(fā)現(xiàn)生殖道鼠衣原體感染后能夠傳播到胃腸道，并在胃腸道長(zhǎng)期持續(xù)存在，這為研究胃腸道衣原體的感染在衣原體致病中的作用奠定了基礎(chǔ)，有助于進(jìn)一步研究衣原體的致病機(jī)制及生殖道衣原體傳播到胃腸道的

圖 1:顯微鏡下觀察小鼠脫落細(xì)胞及組織中衣原體含量及包涵體形態(tài)，藍(lán)色顯示Hela 細(xì)胞核，綠色熒光顯示為鼠衣原體包涵體1.2.2 純化的 CM EB 濃度取-80℃冰箱凍存的 EB，用 SPG 緩沖液倍比稀釋，分別感染 24 孔板蓋玻片上培養(yǎng)的單層 Hela 細(xì)胞，間接免疫熒光染色，熒光顯微鏡下不同視野、不同稀釋倍數(shù)、不同放大倍數(shù)下的衣原體包涵體形成單位（IFUs）計(jì)數(shù)結(jié)果如下（表1-1）；

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉全忠;;泌尿生殖道沙眼衣原體感染展望[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)文摘(皮膚科學(xué));2016年03期

2 岳曉麗;龔向東;滕菲;蔣寧;李婧;門佩旋;王建;;2008-2015年中國(guó)性病監(jiān)測(cè)點(diǎn)生殖道沙眼衣原體感染流行特征分析[J];中華皮膚科雜志;2016年05期

本文編號(hào)：2792298