【摘要】： 目的：真菌病是一種常見的皮膚科疾病，雖然對其發(fā)病機制已基本明了，但治療較困難，用藥以口服藥物為主，耗時長，花費大。這就要求醫(yī)師在選擇用藥時必須有針對性。目前臨床上應(yīng)用較廣泛的藥物篩選實驗是通過體外藥基法測定藥物的MIC值，但因這種方法受體外環(huán)境如溫度、濕度和培養(yǎng)基種類等因素影響較大，所以各家試驗結(jié)果不一。而且體外試驗條件與體內(nèi)藥物實際作用環(huán)境不同，不能確切反映藥物在體內(nèi)的抗真菌效能大小，如何考察藥物在甲板內(nèi)的抗真菌活性成了一個急待解決的問題。本實驗正是從這一問題著手展開研究，目的有二個，一是經(jīng)人工手段破壞離體甲板，再在甲板上種植真菌，最終經(jīng)甲板病理切片證實有真菌的侵入，從而創(chuàng)建體外甲真菌病的模型。二是用不同濃度的氟康唑浸泡離體甲板，再借用上述方法人為地造成甲真菌病感染，根據(jù)甲板中有無菌絲、孢子結(jié)構(gòu)，確定氟康唑在甲板內(nèi)抑制真菌侵入的最低濃度，將此濃度值與體外藥基法試驗所測MIC值作對比，明確本試驗與體外藥基法試驗結(jié)果有無顯著性差異。 材料和方法：首先建立體外的甲真菌病模型。隨機剪取正常人外緣甲板用蒸餾水清洗去污后加入2.5%NaOH浸泡，經(jīng)3-6小時甲板變軟，從而破壞其致密的角質(zhì)層結(jié)構(gòu)。再用蒸餾水洗去甲板中殘留的NaOH成份，避免堿性物質(zhì)對真菌生長的影響。接下來，將甲板 WP=4 與馬鈴薯葡萄糖（PD）液體培養(yǎng)基共置于4支小試管中，高溫高壓滅菌，備用。挑取四種甲真菌病常見致病菌的菌落，包括皮膚癬菌屬的紅毛，白毛和酵母菌屬的白念，克柔氏念珠菌，制成1-5×107cfu/ml的菌懸液。分別往4支小試管內(nèi)接種四種菌懸液，置于溫箱中25℃培養(yǎng)30天。取出甲板制備病理切片，并作PAS染色，鏡檢結(jié)果顯示各甲板中均有真菌侵入。 其次，在體外甲真菌病模型基礎(chǔ)上做甲板內(nèi)氟康唑藥敏試驗，與體外藥基法試驗所測結(jié)果作對比。仍循上述方法軟化甲板。隨后配制不同濃度的10%二甲基亞砜（DMSO）氟康唑透甲液。共分成針對紅毛、石毛、白念、克柔氏念珠菌的四組試管。根據(jù)體外藥基法測得的氟康唑針對4種真菌MIC值（見附表1），每組又分為100倍MIC，10倍MIC，MIC三個濃度梯度，全部12支試管每支管內(nèi)均加入3塊甲板浸泡20天。取出甲板，放進(jìn)盛有PD液體培養(yǎng)基的試管，將紅毛、石毛、白念、克柔氏念珠菌的菌懸液，分組接種于試管中，培養(yǎng)30天后制備甲病理切片觀察。只有每管3塊甲板切片均未見真菌結(jié)構(gòu)，方能判定該組菌種對該管濃度下氟康唑敏感。 結(jié)果：在建立體外甲真菌病模型的試驗中，各管均見明顯菌落生長，鏡下的切片中甲板角質(zhì)層遭破壞，角質(zhì)層內(nèi)可見數(shù)目不等的菌絲孢子，形態(tài)與取自甲真菌病患者病甲的切片所見一致，證明離體甲板的甲真菌病致病模型成功建立。 在測定甲板中氟康唑抗真菌活性的實驗中，菌落生長較前減慢。作甲病理切片，只有石毛組100倍MIC濃 WP=5 度管內(nèi)全部3塊甲板均未見真菌結(jié)構(gòu)，將此濃度值與體外藥基法所測MIC值作一對比，前者遠(yuǎn)高于后者，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，二者有顯著性差異。 結(jié)論：1.正常人離體甲板的致密結(jié)構(gòu)被破壞后，在甲板上接種真菌，給予適宜的溫度、營養(yǎng)等條件，就可以建立體外甲真菌病的感染模型。 2.體外藥基法所測MIC值不能確切反映藥物如氟康唑在甲板內(nèi)的抑真菌作用大小，從此次實驗結(jié)果看，要達(dá)到抑制真菌侵入甲板的作用，甲板內(nèi)氟康唑濃度必須要高于體外所測MIC濃度。 3.當(dāng)懷疑某一真菌為甲真菌病致病菌時，將此菌菌株接種到經(jīng)軟化處理的離體甲板上，根據(jù)甲板切片中是否有菌絲或孢子，可判定其是否為真正致病菌，這樣就為發(fā)現(xiàn)新的致病菌開辟了一條新的檢驗途徑。 4.遵循本實驗思路，用不同濃度外用藥浸泡甲板，之后接種真菌，由甲板切片觀察真菌能否入甲，可用來論證外用藥治療甲真菌病的療效和最佳濃度。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R756

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 楊伯艷;華西醫(yī)院門診甲真菌病病原菌構(gòu)成及患者口服抗真菌藥治療依從性分析[D];四川大學(xué);2007年

本文編號：2785638