【摘要】：背景:惡性黑色素瘤多發(fā)于皮膚,雖然發(fā)病率僅占所有皮膚癌的4%,但其死亡率卻占皮膚癌死亡率的80%;只有14%的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者存活了五年,而且皮膚黑素瘤的發(fā)病率逐年增加。p53是一種常見(jiàn)的腫瘤抑制因子,并且由于其對(duì)細(xì)胞周期和凋亡基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控而被廣泛研究。p53限制糖酵解并驅(qū)動(dòng)ETC裝配和維持所需基因的轉(zhuǎn)錄。除了線粒體活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之外,p53還直接作用于線粒體以通過(guò)與Bcl-2家族成員的相互作用來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以響應(yīng)應(yīng)激。p53作為Bax的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)劑,p53是DNA損傷與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)聯(lián)。同時(shí),p53還限制糖酵解并通過(guò)許多途徑抑制過(guò)度的核苷酸、氨基酸和脂肪酸合成,惡性黑色素瘤代謝引起了人們的關(guān)注。代謝重編程是癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的能量基礎(chǔ)。UT-B是參與尿素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的膜通道蛋白。已有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)膀胱癌中尿素通道蛋白B(urea transporter B,UT-B)的表達(dá)下降,并且隨著腫瘤惡性度增加。UT-B是膜上介導(dǎo)尿素快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的通道蛋白,主要在腎臟表達(dá)參與尿濃縮功能,還廣泛分布于皮膚、大腦、心臟、肝臟等腎外組織。已有實(shí)驗(yàn)證明改變膜上UT-B的表達(dá)會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)外尿素的瞬時(shí)濃度,可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞氨基酸、糖、脂肪等的變化,從而影響細(xì)胞能量代謝。因此,人們推測(cè)UT-B可能通過(guò)黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。p53在暴露于高鹽和尿素后啟動(dòng)細(xì)胞周期延遲中發(fā)揮重要作用,因此可能提供足夠的時(shí)間修復(fù)DNA損傷或啟動(dòng)細(xì)胞凋亡,這可以阻止受損DNA的增殖。文獻(xiàn)報(bào)道UT-B基因敲除小鼠的心肌細(xì)胞發(fā)生線粒體功能障礙,能量代謝重構(gòu)。提示過(guò)表達(dá)UT-B引起的細(xì)胞凋亡可能與線粒體凋亡途徑有關(guān)。目的:瞬時(shí)轉(zhuǎn)染UT-B表達(dá)質(zhì)粒,使B16細(xì)胞中UT-B的表達(dá)上調(diào),通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)研究UT-B過(guò)表達(dá)后對(duì)黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,并初步探討其作用機(jī)制。方法與結(jié)果:(1)人黑色素瘤組織中UT-B表達(dá)下降我們應(yīng)用HE免疫組織化學(xué)染色方法,檢測(cè)人皮膚癌芯片(上海芯超公司)各組織中UT-B的表達(dá)水平。在正常皮膚組織中可見(jiàn)UT-B陽(yáng)性表達(dá),主要是在基底層細(xì)胞可見(jiàn)大量棕黃色斑片和顆粒。在芯片中的8例皮膚黑色素瘤組織中僅有少量棕色顆粒和斑片,在黑色素瘤中UT-B蛋白表達(dá)降低。我們又收集人皮膚痣和人黑色素瘤組織4例,提取RNA進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn),檢測(cè)UT-B mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示其中3例患者的黑色素瘤組織幾乎沒(méi)有UT-BmRNA的表達(dá),另1例黑色素瘤組織中UT-B mRNA有弱表達(dá),進(jìn)一步證實(shí)了黑色素瘤發(fā)展過(guò)程中UT-B mRNA和蛋白水平都明顯下降。(2)黑色素瘤B16細(xì)胞中過(guò)表達(dá)UT-B后細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制、凋亡增加RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)黑色素B16細(xì)胞株中無(wú)UT-B mRNA表達(dá)。通過(guò)轉(zhuǎn)染UT-B表達(dá)質(zhì)粒,上調(diào)B16細(xì)胞中UT-B的表達(dá)水平,對(duì)照組轉(zhuǎn)染p CDNA3.1空質(zhì)粒。Western Blotting和免疫熒光檢測(cè)證實(shí)B16細(xì)胞轉(zhuǎn)染pUT-B 48h后具有較高的UT-B蛋白表達(dá)水平。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染UT-B表達(dá)質(zhì)粒后,相比于對(duì)照組,B16細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期阻滯。MTT實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)染pUT-B 48h后,B16細(xì)胞的生長(zhǎng)活力下降(下降到對(duì)照組的32.4%),劃痕實(shí)驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)UT-B后的B16細(xì)胞的遷移能力也明顯下降4倍左右,并且克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示B16細(xì)胞的克隆形成能力下降。以上結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)UT-B抑制了B16細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。Annexin V/PI染色后應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染UT-B表達(dá)質(zhì)粒后,相比于對(duì)照組(6.85%±1.24%),B16細(xì)胞凋亡明顯增加(11.63%±1.67%,p0.05)。Hoechst染色顯示過(guò)表達(dá)UT-B的B16細(xì)胞中核固縮和核碎片狀增加,凋亡小體增多(p0.05),也證明細(xì)胞凋亡增加。另外,Western Blotting實(shí)驗(yàn)表明促凋亡蛋白Bax和Cleaved-Caspase3的表達(dá)水平增加(p0.05),抑凋亡蛋白Bcl2的蛋白表達(dá)水平下降(p0.05),說(shuō)明過(guò)表達(dá)UT-B后促進(jìn)了B16細(xì)胞凋亡。(3)黑色素瘤B16細(xì)胞中過(guò)表達(dá)UT-B后可能通過(guò)激活p53、線粒體損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡據(jù)報(bào)道UT-B基因敲除小鼠的心肌細(xì)胞中線粒體功能障礙,提示UT-B表達(dá)水平的變化極可能影響線粒體功能。DCFH-DA熒光探針染色后應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞ROS水平,結(jié)果顯示UT-B表達(dá)48h后,B16細(xì)胞中ROS產(chǎn)生增多(比對(duì)照組增加18.7%,p0.05),線粒體膜電勢(shì)下降(p0.05),而細(xì)胞耗氧量明顯下降(降低到對(duì)照組的54.8%,p0.05)。同時(shí)Western Blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)UT-B的細(xì)胞中線粒體電子傳遞鏈中復(fù)合體I,III,IV和V的相關(guān)重要亞基NDUFV1,CYC1,COX7C和ATP5F1的表達(dá)水平明顯下降(p0.05),清除氧自由基相關(guān)酶SOD2的表達(dá)水平也明顯下降(p0.05),CYC1從線粒體釋放至胞質(zhì)明顯增加。以上說(shuō)明UT-B過(guò)表達(dá)后B16細(xì)胞線粒體功能下降,從而啟動(dòng)線粒體凋亡途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在UT-B基因敲除小鼠中膀胱上皮細(xì)胞的線粒體損傷是p53依賴性的,本研究也調(diào)查了黑色素瘤中過(guò)表達(dá)UT-B是否也是與p53有關(guān)。應(yīng)用Western Blotting發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)UT-B上調(diào)了B16細(xì)胞中p53和下游p21的表達(dá)。AKT的激活促進(jìn)MDM2的核進(jìn)入,降低p53的細(xì)胞水平。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染UT-B表達(dá)質(zhì)粒后p-AKT的表達(dá)水平下調(diào),與之相對(duì)應(yīng)MDM2表達(dá)下調(diào)(p0.05)。以上說(shuō)明轉(zhuǎn)染UT-B表達(dá)質(zhì)粒抑制B16細(xì)胞增殖可能通過(guò)激活p53和線粒體途徑誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。(4)脂代謝相關(guān)酶的表達(dá)和糖攝取在B16細(xì)胞中,在過(guò)表達(dá)UT-B后,Western Blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1的表達(dá)降低,并且分光光度計(jì)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)葡萄糖攝取減少。RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)脂肪合成關(guān)鍵酶FASN,SREBP1的mRNA的表達(dá)降低。以上結(jié)果說(shuō)明在B16細(xì)胞中過(guò)表達(dá)UT-B可能會(huì)影響細(xì)胞糖代謝和脂代謝。(5)在小鼠黑色素瘤移植瘤中UT-B過(guò)表達(dá)也明顯抑制腫瘤生長(zhǎng),可能與p53途徑有關(guān)構(gòu)建小鼠黑色素瘤移植瘤模型,將小鼠分成PQ組、PQ-P(PQ-p CDNA3.1)組和PQ-U(PQ-UT-B)組。以具有腫瘤靶向性的減毒沙門(mén)氏菌作為運(yùn)載體,攜帶p CDNA3.1和pUT-B,以尾靜脈注射的方式給予小鼠,觀察腫瘤生長(zhǎng)情況和小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)。結(jié)果顯示PQ-U組腫瘤中UT-B的表達(dá)水平高于對(duì)照組PQ組和PQ-P組。腫瘤中過(guò)表達(dá)UT-B進(jìn)行治療(14天),腫瘤體積增長(zhǎng)速率和重量都較對(duì)照組明顯降低,說(shuō)明過(guò)表達(dá)UT-B抑制了黑色素瘤生長(zhǎng)。同時(shí)Western Blotting檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞中BAX上調(diào),Bcl2下調(diào)。過(guò)表達(dá)UT-B增加了p53和p21的表達(dá)水平,降低了Mmd2和p-AKT的表達(dá)水平。結(jié)論:1、與人正常皮膚相比,人黑色素瘤組織中具有較低的UT-B表達(dá)水平,推測(cè)改變UT-B表達(dá)可能會(huì)影響黑素瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。2、UT-B能誘導(dǎo)B16細(xì)胞中促凋亡蛋白BAX和Cleaved-Caspase3表達(dá)顯著升高,同時(shí)還低表達(dá)抑凋亡蛋白Bcl2。表明UT-B具有促進(jìn)B16細(xì)胞凋亡,抑制其生長(zhǎng)和增殖的作用。3、UT-B能誘導(dǎo)B16細(xì)胞中線粒體膜電位下降,線粒體中細(xì)胞色素C表達(dá)減少,細(xì)胞中細(xì)胞色素C表達(dá)增多,表明UT-B可能是通過(guò)線粒體途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡。4、UT-B能誘導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glut1表達(dá)減少,抑制細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的攝取,并降低脂肪酸合成酶關(guān)鍵酶的表達(dá),表明UT-B對(duì)細(xì)胞的抑制作用可能與代謝抑制有關(guān)。5、UT-B能抑制磷酸化AKT表達(dá),通過(guò)p53的負(fù)調(diào)控因子MDM2激活p53,p53,來(lái)抑制糖代謝與脂代謝和誘導(dǎo)線粒體途徑凋亡,抑制黑色素瘤B16細(xì)胞生長(zhǎng)。綜上所述,B16細(xì)胞中上調(diào)UT-B表達(dá)水平后,通過(guò)激活p53,來(lái)抑制糖代謝與脂代謝和誘導(dǎo)線粒體途徑凋亡抑制黑色素瘤B16細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖,促進(jìn)其死亡。我們已經(jīng)證實(shí)了UT-B在皮膚黑素瘤發(fā)展中的作用,為黑色素瘤的治療提供新的策略。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R739.5

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本文編號(hào)：2783160