【摘要】：研究背景銀屑病是一種常見的慢性免疫炎癥性增生性皮膚病,病程長,且易復(fù)發(fā)。臨床表現(xiàn)主要以紅斑,鱗屑,瘙癢為主。銀屑病的主要組織病理學(xué)表現(xiàn)為表皮細(xì)胞過度角化,炎細(xì)胞浸潤以及毛細(xì)血管增生。銀屑病的病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚。但目前認(rèn)為銀屑病的發(fā)生不是單一因素的結(jié)果,可能涉及多個方面,如遺傳背景、感染、免疫異常、內(nèi)分泌因素、精神緊張等。目前,臨床上用于治療銀屑病的藥物副作用大,并且無法達(dá)到根治的目的。因此尋找新的藥物靶點(diǎn)具有十分重要的意義。CX-5461是一種新型的特異性RNA聚合酶Ⅰ(PolⅠ)抑制劑。以往研究證實(shí),CX-5461能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖,對某些白血病和實(shí)體腫瘤表現(xiàn)出較好的治療效果。我們課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn),CX-5461對機(jī)械損傷引起的動脈血管內(nèi)膜增生和再狹窄有顯著的抑制作用,對移植后血管新生內(nèi)膜增生和血管炎癥的發(fā)展也有抑制作用,并且CX-5461能夠有效抑制心肌成纖維細(xì)胞的活化及表型轉(zhuǎn)化。CX-5461是否對銀屑病病變的發(fā)生發(fā)展有抑制作用目前尚沒有研究。研究目的在本研究中,我們使用成熟的銀屑病模型和血管新生模型,探索PolⅠ特異性抑制劑CX-5461 對銀屑病以及內(nèi)皮細(xì)胞血管新生功能的藥理作用。研究方法用咪喹莫特乳膏處理C57BL/6小鼠皮膚建立銀屑病模型。CX-5461溶于DMSO中,局部皮膚涂抹給藥。將小鼠隨機(jī)分成4組:正常對照組(sham)、造模+ DMSO組(溶劑對照)、造模+CX-5461低劑量組(2μM)、造模+CX-5461高劑量組(5μM)。局部涂抹治療1周后,取材進(jìn)行組織病理學(xué)和分子生物學(xué)檢測。HE染色觀察角質(zhì)層厚度變化。免疫組織化學(xué)染色觀察炎癥細(xì)胞CD68陽性細(xì)胞數(shù)量。Lectin和CD31染色觀察血管新生情況。用實(shí)時定量PCR方法檢測腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-17、IL-23、IL-6、IL-8、IL-10、IL-1[β的表達(dá)。體外培養(yǎng)人角質(zhì)形成細(xì)胞(Hacat),用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。用皮下種植海綿墊以及腹部皮下注射Matrigel方法建立血管新生模型。將種植海綿墊的C57BL/6小鼠隨機(jī)分成4組:生理鹽水對照組、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)刺激組、CX-5461組、CX-5461 +VEGF組。將腹部皮下注射Matrigel的C57BL/6小鼠隨機(jī)分成3組:Matrigel組、CX-5461低劑量組(2μM)組、CX-5461高劑量組(55μM)。2周后取材進(jìn)行組織學(xué)檢測。免疫組織化學(xué)及Lectin染色觀察新生血管數(shù)量的變化。體外培養(yǎng)人毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力,用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力,用小管成型實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的成管能力,用流式細(xì)胞術(shù)檢測CX-5461對細(xì)胞周期的影響。用Western bolt檢測內(nèi)皮細(xì)胞中p53及磷酸化p53的蛋白水平。研究結(jié)果在銀屑病模型中,CX-5461明顯改善了銀屑病的皮膚癥狀(病變皮膚表面鱗屑減少,皮膚皺褶減少,紅腫明顯減輕)。HE染色結(jié)果顯示,與溶劑對照組相比,CX-5461治療明顯抑制了角質(zhì)細(xì)胞的增生。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),CX-5461治療組病變部位的新生血管數(shù)量與溶劑對照組相比明顯減少。另外我們發(fā)現(xiàn)CX-5461能夠減輕病變部位的炎癥反應(yīng)。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,CX-5461治療組CD68+細(xì)胞數(shù)明顯減少。實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示CX-5461 治療組 TNF-α、IL-17、IL-23、IL-lβ 的表達(dá)水平下降,而 IL-6、IL-8、IL-10的表達(dá)升高。在皮下種植PVA海綿墊血管新生模型中,CD31染色及Lectin化學(xué)染色顯示,VEGF組與對照組相比血管數(shù)量明顯增加;CX-5461治療顯著減少了基礎(chǔ)水平和VEGF刺激后的血管新生過程。在Matrigel膠血管新生模型中,CD31免疫化學(xué)染色顯示,CX-5461治療顯著減少了血管新生數(shù)量。體外培養(yǎng)的細(xì)胞中,CX-5461對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖有劑量依賴性的抑制作用。同時,CX-5461能明顯抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力和成管能力。并且,CX-5461對角質(zhì)形成細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期有抑制作用,可以將細(xì)胞阻滯在G2/M期。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,CX-5461對p53蛋白總量的作用不明顯,但能顯著增加p53磷酸化水平。用p53抑制劑PFT-α預(yù)處理能夠減輕CX-5461對內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制作用,而對內(nèi)皮細(xì)胞成管能力的作用不明顯。結(jié)論局部應(yīng)用CX-5461能有效抑制銀屑病病變的發(fā)生發(fā)展,減輕炎細(xì)胞浸潤和病變部位的血管新生。CX-5461抑制血管新生的作用可能與激活p53通路有關(guān)。因此,特異性Po1 Ⅰ抑制劑可能為開發(fā)治療銀屑病的新型藥物制劑提供線索。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R758.63
【圖文】：

圖１邋ＣＸ－５４６１對咪喹莫特（ＩＭＱ）誘導(dǎo)的銀屑病病變的藥理作用逡逑．大體觀察ＩＭＱ誘導(dǎo)的皮膚銀屑病樣改變（紅斑及白色鱗屑）。ＣＸ－５４６１減輕銀屑病樣皮損（統(tǒng)計觀察：紅斑鱗屑面積／皮損暴露總面積）。Ｂ．ＨＥ染色觀察ＣＸ－５４６１對表皮層厚度的影響。右側(cè)為統(tǒng)計數(shù)據(jù)圖（平準(zhǔn)差）。＊＊＊Ｐ＜0．000ｌ，ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡ，ｎ＝７。逡逑

圖２邋ＣＸ－５４６１對ＩＭＱ誘導(dǎo)的銀屑病病變部位血管新生的影響逡逑Ａ．ＣＤ３１免疫組織化學(xué)染色顯示病變部位毛細(xì)血管（紅色箭頭）數(shù)量變化（左：逡逑２0ｘ放大倍數(shù)；右：左圖方框內(nèi)放大）。Ｂ．紅色熒光標(biāo)記的Ｌｅｃｔｉｎ染色觀察各逡逑組病變部位毛細(xì)血管數(shù)量變化（白色箭頭）。下方為統(tǒng)計數(shù)據(jù)圖（平均值土標(biāo)準(zhǔn)逡逑差）。＊Ｐ＜邋０．０５，＊＊＊Ｐ＜０．０００１，ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡ，邋ｎ＝７逡逑２８逡逑

圖３邋ＣＸ－５４６１對病變部位皮膚炎癥反應(yīng)的影響逡逑Ａ．邋ＣＤ６８免疫組織化學(xué)染色顯示真皮層單核巨噬細(xì)胞浸潤情況的變化（紅色箭逡逑頭）。右側(cè)為統(tǒng)計結(jié)果。Ｂ．實(shí)時定量ＰＣＲ結(jié)果顯示，ＣＸ－５４６１治療后病變部位逡逑細(xì)胞因子邋ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０邋表達(dá)升高，ＴＮＦ－ｏｕ邋ＩＬ－ｉｐ、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３邋的表達(dá)降逡逑低。＊Ｐ＜０．０５，＊＊＊Ｐ＜０．０００１，ｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡ，ｎ＝７逡逑２９逡逑

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