【摘要】： 皮膚鱗狀細胞癌(Squamous cell carcinoma,SCC)的發(fā)病率有逐年增高趨勢,但其病因及具體發(fā)病機制尚未完全闡明,近年的資料表明可能與下列因素有關:1、紫外線輻射;2、人乳頭瘤病毒(HPV);3、化學致癌物質(zhì)的接觸;4、癌前期皮膚病及免疫抑制劑的應用;5、其他皮膚病:慢性潰瘍、燒傷或外傷性瘢痕等;6、熱損傷。目前SCC的治療多為非特異性療法,并不針對腫瘤自身的發(fā)病特點,所以不良反應較常見。因此,開發(fā)新型的、針對腫瘤特定發(fā)病機制的治療更具前景,也引起國內(nèi)外皮膚界學者的廣泛關注。 Hedgehog(Hh)信號通路是近年來倍受關注的一個調(diào)控胚胎發(fā)育的信號轉導途徑。研究表明,Hh信號通路在基底細胞癌(Basal cell carcinoma,BCC)等多種腫瘤的發(fā)病及治療中起著重要作用。Cyclopamine(環(huán)杷明)是Hh通路的特異性抑制劑,它可以特異性抑制該通路的活性,已成為一種潛在的抗腫瘤藥物。既往研究和我們的初步工作發(fā)現(xiàn)SCC的發(fā)生、發(fā)展與Hh通路的異常激活有關。為進一步明確Hh信號通路在SCC發(fā)病和治療中的作用,本課題以五種人SCC細胞系為研究對象,體外觀察cyclopamine特異性抑制Hh信號通路對SCC細胞增殖、凋亡及其細胞周期的影響。 目的:探討cyclopamine特異性抑制Hedgehog信號轉導通路對人SCC細胞增殖及凋亡的影響。 方法:體外培養(yǎng)五種人SCC細胞株,經(jīng)cyclopamine處理后,分別采用MTT法測定cyclopamine對SCC細胞增殖的抑制作用,光鏡下觀察細胞形態(tài)變化,采用流式細胞儀PI染色法檢測cyclopamine對SCC細胞周期分布的影響,并用流式細胞儀Annexin-V-FITC/PI雙重標記法檢測細胞凋亡的變化。 結果: 1、Cyclopamine抑制Hh通路對SCC細胞的形態(tài)學影響 體外常規(guī)培養(yǎng)五種鱗癌細胞系A431、Sa3、HSQ-89、Tca、HSC-2,在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化及生長情況。五種細胞均呈貼壁生長,鏡下觀察結果顯示:空白對照組和陰性對照組的細胞形態(tài)規(guī)則,輪廓清晰;與對照組細胞形態(tài)比較,cyclopamine組細胞生長緩慢,立體感消失,細胞內(nèi)顆粒增多,胞質(zhì)皺縮,核固縮現(xiàn)象明顯,細胞變小變圓,輪廓變模糊。形態(tài)學結果表明cyclopamine作用后的各SCC細胞系生長受到抑制,形態(tài)受損。 2、Cyclopamine對SCC細胞增殖的抑制作用 MTT比色法檢測不同濃度(依次為:0.5、1、2、5μmol/L)cyclopamine對鱗癌細胞生長的劑量效應影響,結果表明cyclopamine能劑量依賴性地抑制五種鱗癌細胞的生長,其中以5μM濃度時抑制作用最為明顯。選取5μM cyclopamine作用于培養(yǎng)的細胞5～8天,檢測其抑制鱗癌細胞生長的時間效應。結果表明cyclopamine對各SCC細胞系的增殖抑制也具有時間依賴性。 3、Cyclopamine對SCC細胞的凋亡誘導作用 選取5μM cyclopamine作用于SCC細胞48h,采用Annexin-V-FITC/PI雙重染色,流式細胞儀檢測凋亡率的變化。結果顯示,除HSQ-89細胞的凋亡率未檢測到明顯改變外,cyclopamine組的A431、Sa3、Tca、HSC-2四種細胞凋亡率(早期+晚期凋亡率)均較空白對照組明顯增加(P0.05)。結果表明cyclopamine能夠明顯誘導SCC細胞發(fā)生凋亡,對不同的SCC細胞系,其凋亡誘導作用不同。 4、Cyclopamine對SCC細胞的周期阻滯作用 5μM cyclopamine作用于SCC細胞48h,PI染色后流式細胞儀檢測cyclopamine對SCC細胞周期分布的影響。結果顯示:Tca細胞的實驗組G_2/M期細胞較空白對照組明顯增多,A431、Sa3、HSC-2三種細胞的實驗組G_0/G_1期細胞較空白對照組明顯增多,G1期前出現(xiàn)較對照組更為明顯的亞二倍體峰;HSQ-89的細胞實驗組與對照組未檢測到明顯差別。結果表明:Cyclopamine抑制Hh通路能夠影響SCC細胞的正常周期活動,它可誘導Tca細胞發(fā)生G_2/M期阻滯,誘導A431、Sa3、HSC-2細胞發(fā)生G0/G1期阻滯。 結論:Hedgehog信號通路的特異性抑制劑cyclopamine能夠有效抑制SCC細胞的增殖,誘導細胞凋亡,誘導細胞發(fā)生特定細胞周期的阻滯為其可能機制之一。該結果為進一步深入研究SCC的發(fā)病機制及探索新的治療方法提供了一定的理論依據(jù)。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R739.5
【圖文】：

圖 1 Hedgehog 信號轉導途徑示意圖Hedgehog信號通路與凋亡亡(apoptosis)，又稱程序性細胞死亡。Kerr 等對凋亡細胞的超了如下描述：凋亡早期細胞核固縮、邊緣化、胞漿濃縮；晚

圖 2-1 Sa3 - 空白對照組 倒置顯微鏡下 圖 2-2 Sa3  cyclopamine 組 倒置顯微鏡下細胞形態(tài) ×200 細胞形態(tài) ×200

圖 2-1 Sa3 - 空白對照組 倒置顯微鏡下 圖 2-2 Sa3  cyclopamine 組 倒置顯微鏡下細胞形態(tài) ×200 細胞形態(tài) ×200

【共引文獻】

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本文編號：2768091