【摘要】：研究背景 掌跖角化病(Palmoplanter keratoderma,PPK)又稱掌跖角皮病,是掌跖部皮膚異常增厚、角化過度為特點的一類慢性皮膚病。臨床上,根據有無家族史,可將其分為遺傳性和獲得性。前者可表現(xiàn)為顯性、隱性或X連鎖遺傳;根據組織病理學特征,將其分為表皮松解型、非表皮松解型、汗孔角化型掌跖角化病;根據皮損形態(tài)將其分為彌漫性、局灶性、條紋狀、點狀掌跖角化病。點狀掌跖角化病(Punctate palmoplanter keratoderma,PPPK),人類孟德爾遺傳在線(Online Mendelian inheritance in Man database,OMIM)編號 148600,是一種以掌跖部不規(guī)則分布、進行性加重的角化性丘疹為特征的常染色體顯性遺傳性皮膚病。PPPK影響患者身心健康和生活質量,目前尚無有效根治方法。探索PPPK發(fā)病規(guī)律、尋找PPPK致病基因是現(xiàn)階段該病研究熱點。對于致病基因明確的單基因病,對已知致病基因進行直接測序就可以找到致病突變位點。截止目前,已報道38個α/γ-銜接蛋白結合蛋白(Alpha-and gamma-adaptin binding Protein,AAGAB)基因突變位點和 1 個 XIV 型膠原纖維 α1鏈基因(Collagen Type XIV Alpha 1 Chain,COL14A1乃突變位點與PPPK發(fā)病有關,其中COL14A1基因突變致病性尚有待于進一步蛋白質功能學研究證實和候選基因重復性驗證。此外,仍有部分報道中國漢族人PPPK家系未發(fā)現(xiàn)上述相關致病突變位點。這說明PPPK可能存在遺傳異質性,即該病除上述致病基因之外,可能還存在其他致病基因。人類外顯子組序列僅占人類整個基因組1%,在已發(fā)現(xiàn)的人類單基因遺傳病中,約85%致病突變都位于這1%的蛋白質編碼序列。對于有遺傳異質性或致病基因不明的單基因病,全外顯子組測序是目前尋找其致病基因的最有效手段。目的(1)分析一個中國漢族人點狀掌跖角化病家系臨床表型及遺傳學特征;(2)尋找其致病基因,提供疾病及遺傳咨詢。方法(1)收集來自安徽省銅陵市一個漢族人PPPK家系。通過家系調查,分析其臨床表型及遺傳學特征。同時,家系采集小組抽取第二、第三代所有家系成員靜脈血各4ml抗凝處理后,超低溫冰箱保存。(2)提取基因組DNA;設計AAGAB基因10個外顯子10對引物;聚合酶鏈反應(PCR)擴增家系患者AAGAB基因10個外顯子及其側翼序列,對擴增產物進行直接測序。(3)若該家系患者AAGAB基因編碼區(qū)未發(fā)現(xiàn)致病突變位點,進一步采用全外顯子組測序技術尋找該家系致病基因:①選取家系內臨床表型顯著且嚴重程度相近2名患者(Ⅱ2和Ⅱ5)外周靜脈血,提取基因組DNA;②將基因組DNA隨機打斷、末端修復、連接,制備線性文庫;③制備成雜交文庫;④基因組DNA全外顯子組捕獲、富集,對富集后片段進行PCR擴增;⑤PCR產物進行高通量測序;⑥使用Il1umina堿基識別軟件讀取原始圖像文件;⑦使用Burrows-Whee1erAligner軟件與人類參考基因組(GRCh37/HG19)進行比對;⑧使用 GATK(v3.3.0)HaplotypeCaller 軟件識別基因組單核苷酸變異(Single nucleotide varians,SNVs)和插入缺失(Insertion and Deletions,InDels)變異;⑨通過與dbSNP庫、1000 Genomes及病例共有等方式進行比對,過濾掉常見SNVs和InDels(去除dbSNP庫、1000 Genomes等數(shù)據庫中次等位頻率=1%SNVs/InDels);同時鑒別SNVs和InDels是否導致蛋白編碼發(fā)生變化和氨基酸發(fā)生改變;或者編碼區(qū)非同義突變SNVs的SIFT(Sorting Intolerant From Tolerant)值是否小于 0.05,或者 Polyphen(Polymorphism Phenotyping)軟件預測氨基酸改變對蛋白質生物學功能的影響是否有害。(4)選取2名患者共有、與皮膚代謝有關的罕見或新發(fā)變異位點為該家系候選突變位點。對全外顯子組測序鑒定出的候選突變位點,設計引物;分別對家系內另外3例患者和第二、三代正常成員及120名50歲以上來我院健康體檢的正常人基因組DNA目標位點及上下游區(qū)域進行PCR擴增;PCR產物純化后,DNA測序;將測序結果在家系內進行基因型-表型共分離分析。結果(1)臨床表型特征:該家系PPPK患者均在25歲左右發(fā)病;起初皮疹表現(xiàn)為針頭大小、淡黃色、半透明的角化性丘疹,隨年齡增長,皮疹數(shù)量多、體積增大,嚴重者角化性丘疹融合成斑塊,以掌跖著力處最為顯著;雙足跖處皮損明顯重于雙手掌;雙手掌心和雙足弓內側等非著力處皮損較輕或缺如;第二代患者皮損明顯重于第三代;同輩患者中,勞動強度大者,皮損癥狀重。(2)該家系4代,共34人,患者6例,其中男性3例,女性3例,連續(xù)3代均有發(fā)病,符合常染色體顯性遺傳模式。(3)該家系患者AAGAB基因10個外顯子及其側翼序列未發(fā)現(xiàn)致病突變位點及單核苷酸多態(tài)性位點。(4)全外顯子組測序結果顯示,樣品Ⅱ2平均測序深度137.51,覆蓋度99.79%,測序深度≥20x目標區(qū)域的覆蓋度97.89%;樣品Ⅱ5平均測序深度148.03,覆蓋度99.71%,測序深度≥20x目標區(qū)域的覆蓋度97.76%。經過數(shù)據過濾和比對,篩選出兩者共有的位于編碼區(qū)和剪切位點的罕見和新發(fā)SNVs和InDels變異數(shù)分別為40和60個。對以上100個變異位點進行蛋白質表達、功能及致病性進行具體分析。其中與皮膚代謝有關的3個罕見及新發(fā)變異位點及對應基因名稱分別為FLG基因(NM_002016.1:c.1333_1334insCCCA →p.Leu445Arg446)、HRNR基因(M_001009931.2:c.8292_8293insCT→p.Ala2764Gly2765)、CELA1基因(NM_001971,5:c.419delC→р.Ala140Val)。Sanger法DNA測序證實該家系內患者攜帶糜蛋白酶樣彈力蛋白酶 1(Chymo-trypsin like elastase family member 1,CLA1)基因第 5 外顯子с.419delC雜合移碼突變,正常家系成員及120名正常人均不攜帶該突變,符合基因型與表型共分離。結論(1)本研究PPPK家系患者皮損嚴重程度與后天因素尤其是掌跖部位長期摩擦、刺激、受力等有關。(2)本研究家系遺傳方式符合常染色體顯性遺傳。(3)本研究家系PPPK發(fā)病與AAGAB基因編碼區(qū)突變無關聯(lián);PPPK存在其他致病基因。(4)CELA1基因c.419delC雜合移碼突變可能是本研究家系致病變異位點。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R758.5
【圖文】：

圖１全外顯子組測序信息分析流程逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｔｈｅ邋ｗｈｏｌｅ邋ｅｘｏｍｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｉｎ呂邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｐｉｐｅｌｉｎｅ逡逑．３．邋５變異位點致病性分析逡逑突變不引起編碼氨基酸的改變，移碼突變和無義突變可Ｗ導致大片段蛋碼異常，造成蛋白質功能學改變。非同義突變可＾心引起蛋白質單個或多酸改變，對整體蛋白質功能影響作用有待評估。目前可Ｗ通過ＳＩＦＴ（Ｓｏｒｔｈｌｅｒａｎｔ邋Ｆｒｏｍ邋Ｔｏｌｅｒａｎｔ），邋Ｐｏｌｙｐｈｅｎ邋（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ邋Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）等功能學預測軟同義變異進行功能學預測。ＳＩＦＴ是基于序列同源性和氨基酸的物理性質白質中某個氨基酸替換是否影響該蛋白功能的軟件。為了評估氨基酸替

圖２先證者雙手掌、巧足郎部皮損逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋Ｓｋｉｎ邋ｌｅｓｉｏｎｓ邋ｏｖｅｒ邋ｔｈｅ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ｏｆ邋化ｅ邋ｐｒｏｂａｎｄ’ｓ邋ｐａｌｍｓ邋ａｎｄ邋ｓｏｌｅｓ逡逑２５逡逑

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