【摘要】： 人體內(nèi)廣泛存在著天然自身抗體(natural autoantibody, NAA)，它們對維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的自身穩(wěn)定起著重要的作用。目前國內(nèi)外的學(xué)者已經(jīng)不再把所有自身抗體看作是“可怕的自身毒素”，認(rèn)為NAA是天然存在的自身抗體網(wǎng)絡(luò)的組成部分，積極參與免疫系統(tǒng)自身穩(wěn)定的調(diào)節(jié)。迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證實的NAA有數(shù)百種，其中包括天然抗角蛋白自身抗體(anti-keratin autoantibody, AK auto Ab)。 AK auto Ab是天然自身抗體NAA家族成員之一，廣泛存在于正常人和多種動物體內(nèi)，對皮膚的生理和病理過程具有重要調(diào)節(jié)作用。自從Krogh等于1970年首先發(fā)現(xiàn)AK auto Ab以來，國際上許多學(xué)者圍繞AK auto Ab做了大量工作，如Iwatsuki等發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)任何免疫處理的小鼠脾細(xì)胞可自發(fā)地產(chǎn)生AK auto Ab；Hintner的體外實驗間接發(fā)現(xiàn)AK auto Ab可以促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞對角蛋白凝集物的吞噬。本研究組自20世紀(jì)80年代中期開始對AK auto Ab進(jìn)行了較為深入、細(xì)致的研究，研究進(jìn)展與國際同步，某些方面已處于領(lǐng)先水平。所取得的主要進(jìn)展有：①證實AK 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文2 auto Ah在正常人和多種動物體內(nèi)廣泛存在，明確其與皮膚多種生 理和病理過程密切相關(guān)；②發(fā)現(xiàn) AK auto Ah能夠抑制培養(yǎng)角質(zhì)形 成細(xì)胞伙eratinoc刊e，KC）的增殖代謝，可以抑制KC產(chǎn)生兔疫介 質(zhì)如1＊－6、IL．8，促進(jìn)＊C凋亡：首次提出＊K allt。＊b作為一種 生理機(jī)制在維持皮膚自身穩(wěn)定中具有重要作用。③利用未免疫小鼠 B細(xì)胞獲得了 4株分泌 AK auto Ah的雜交瘤，克隆了抗體的可變 區(qū)基因，發(fā)現(xiàn)其符合NAA的規(guī)律。④利用噬菌體抗體庫技術(shù)獲得 了多株抗角蛋白基因工程抗體。⑤對 AK auto Ah進(jìn)行了應(yīng)用研 究，初步結(jié)果顯示AK auto Ah在銀屑病治療等方面具有良好的臨 床應(yīng)用前景。 在上述關(guān)于 AK auto Ah的研究中，最重要的發(fā)現(xiàn)之一是 AK auto Ah可以抑制培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞及鱗癌細(xì)胞增殖。親和層析 純化的血清AK auto Ah、鼠源性單克隆抗角蛋白抗體、基因工程抗 角蛋白抗體都可顯示這一抑制作用。但是 AK auto Ah發(fā)揮這一作 用的機(jī)理目前尚未完全闡明。以往用 AK auto Ah作用固定后角質(zhì) 形成細(xì)胞（死細(xì)胞）結(jié)合對象是角質(zhì)形成細(xì)胞胞漿內(nèi)的角蛋白，而 且還證實 AK auto Ah對不表達(dá)表皮角蛋白的細(xì)胞不具此作用，因 此，我們推測 AK auto Ah 進(jìn)入體外培養(yǎng)細(xì)胞（活細(xì)胞）胞漿與角 蛋白結(jié)合是其發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。那么胞外的 AK autoAb是如何與活 細(xì)胞胞漿內(nèi)的角蛋白結(jié)合？AK autoAb與角蛋白結(jié)合后又發(fā)生了怎 樣的一系列事件而導(dǎo)致了角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖抑制？這些問題成為 我們目前關(guān)注的焦點(diǎn)。 過去普遍認(rèn)為，抗體發(fā)揮其生物學(xué)活性的區(qū)域僅限于細(xì)胞外介 質(zhì)，而細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)是抗體的禁區(qū)。但近年來大量資料顯示，這種抗 體內(nèi)化現(xiàn)象廣泛存在。抗體能夠穿透活細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞核或 2 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文3 細(xì)胞漿內(nèi)相應(yīng)抗原結(jié)合，干擾細(xì)胞功能，引起細(xì)胞凋亡或死亡。從 而提示 AK auto Ah 可能也能通過抗體內(nèi)化進(jìn)入活細(xì)胞與角蛋白結(jié) 合而發(fā)揮作用。為了證明這一假設(shè)，我們采用免疫酶、共聚焦顯微 鏡和膠體金透射電鏡技術(shù)觀察抗角蛋白抗體到底能否進(jìn)入活細(xì)胞以 及在活細(xì)胞內(nèi)的確切定位。并進(jìn)行基因工程抗角蛋白抗體Fab進(jìn)入 活細(xì)胞觀察，以明確抗角蛋白抗體內(nèi)化是否依賴于FC受體，初步探 討抗角蛋白抗體內(nèi)化的跨膜機(jī)制。 在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步明確了抗角蛋白抗體對Tea cells的 作用，觀察了抗體作用后角蛋白酪氨酸和 P38MAK磷酸化的變化， 探討了抗角蛋白抗體作用于角蛋白后對細(xì)胞功能的影響及作用的機(jī) 制。 主要實驗內(nèi)容和結(jié)果： 一、抗角蛋白單克隆抗體進(jìn)入活細(xì)胞的研究及跨膜機(jī)制初探 1不同濃度抗角蛋白抗體作用TCa細(xì)胞，相同濃度抗角蛋白抗體作用 不同時間。黑素瘤細(xì)胞和抗HBsAg抗體作用的Tea細(xì)胞作為陰性 對照。固定后用 AK auto Ah作用的k 細(xì)胞作為陽性對照。 2 免疫酶、免疫熒光法，Ethidium Homodimer 雙染色。結(jié)果顯示抗 角蛋白抗體能夠進(jìn)入培養(yǎng)的幾 細(xì)胞，共聚焦顯微鏡觀察抗角蛋白 抗體能夠進(jìn)入活凡 細(xì)胞胞漿。 3 全屏熒光定量法定量研究進(jìn)入活Tea 細(xì)胞中抗角蛋白單克隆抗 體，表明進(jìn)入細(xì)胞的抗角蛋白單克隆抗體隨著時間的延長濃度升高 而增多，作用時間達(dá)到一定程度時，不再增加。 4 基因工程抗人角蛋白Fab也能進(jìn)入培養(yǎng)的h 細(xì)胞。說明抗角蛋 白抗體進(jìn)入培養(yǎng)h 細(xì)胞是不依賴k受體的。 3 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文4 二、抗角蛋白單克隆抗體對體外培養(yǎng)細(xì)胞功能影響及作用機(jī)制 IMTT法證明抗角蛋白抗體對n 細(xì)胞增殖抑制作用具有時間、劑量 依賴性。 2用抗角蛋白抗體作用的Tea細(xì)胞經(jīng)處理后制備成超薄切片。然后用 膠體金作用。結(jié)果表明，抗角蛋白抗體
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R751
【圖文】：

抗體培養(yǎng)細(xì)胞(活細(xì)胞)細(xì)胞呈單一著染(x200)

圖6固定細(xì)胞(死細(xì)胞)用抗體作用呈胞漿、胞核雙染色(x40o)光定量法定量研究進(jìn)入活Tca細(xì)胞中抗角蛋白單克隆抗體70抗角蛋白抗體分別作用Tca細(xì)胞30min、lh、Zh、7h、12h。lh一7h內(nèi)隨著時間增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)長時間熒光強(qiáng)度不再增強(qiáng)。下圖7一12是對以上細(xì)胞樣本聚焦掃描的結(jié)果，下圖13是采用全屏熒光定量法獲得的光強(qiáng)度平均值。

1:70抗角蛋白抗體分別作用Tca細(xì)胞30min、lh、Zh、3h、sh、7h、12h。lh一7h內(nèi)隨著時間增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，以后再延長時間熒光強(qiáng)度不再增強(qiáng)。下圖7一12是對以上細(xì)胞樣本相同層面共聚焦掃描的結(jié)果，下圖13是采用全屏熒光定量法獲得的細(xì)胞樣本熒光強(qiáng)度平均值。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2750897