【摘要】： 人體內廣泛存在著天然自身抗體(natural autoantibody, NAA)，它們對維持機體內環(huán)境的自身穩(wěn)定起著重要的作用。目前國內外的學者已經(jīng)不再把所有自身抗體看作是“可怕的自身毒素”，認為NAA是天然存在的自身抗體網(wǎng)絡的組成部分，積極參與免疫系統(tǒng)自身穩(wěn)定的調節(jié)。迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證實的NAA有數(shù)百種，其中包括天然抗角蛋白自身抗體(anti-keratin autoantibody, AK auto Ab)。 AK auto Ab是天然自身抗體NAA家族成員之一，廣泛存在于正常人和多種動物體內，對皮膚的生理和病理過程具有重要調節(jié)作用。自從Krogh等于1970年首先發(fā)現(xiàn)AK auto Ab以來，國際上許多學者圍繞AK auto Ab做了大量工作，如Iwatsuki等發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)任何免疫處理的小鼠脾細胞可自發(fā)地產(chǎn)生AK auto Ab；Hintner的體外實驗間接發(fā)現(xiàn)AK auto Ab可以促進單核巨噬細胞對角蛋白凝集物的吞噬。本研究組自20世紀80年代中期開始對AK auto Ab進行了較為深入、細致的研究，研究進展與國際同步，某些方面已處于領先水平。所取得的主要進展有：①證實AK 第四軍醫(yī)大學博士學位論文2 auto Ah在正常人和多種動物體內廣泛存在，明確其與皮膚多種生 理和病理過程密切相關；②發(fā)現(xiàn) AK auto Ah能夠抑制培養(yǎng)角質形 成細胞伙eratinoc刊e，KC）的增殖代謝，可以抑制KC產(chǎn)生兔疫介 質如1＊－6、IL．8，促進＊C凋亡：首次提出＊K allt。＊b作為一種 生理機制在維持皮膚自身穩(wěn)定中具有重要作用。③利用未免疫小鼠 B細胞獲得了 4株分泌 AK auto Ah的雜交瘤，克隆了抗體的可變 區(qū)基因，發(fā)現(xiàn)其符合NAA的規(guī)律。④利用噬菌體抗體庫技術獲得 了多株抗角蛋白基因工程抗體。⑤對 AK auto Ah進行了應用研 究，初步結果顯示AK auto Ah在銀屑病治療等方面具有良好的臨 床應用前景。 在上述關于 AK auto Ah的研究中，最重要的發(fā)現(xiàn)之一是 AK auto Ah可以抑制培養(yǎng)的角質形成細胞及鱗癌細胞增殖。親和層析 純化的血清AK auto Ah、鼠源性單克隆抗角蛋白抗體、基因工程抗 角蛋白抗體都可顯示這一抑制作用。但是 AK auto Ah發(fā)揮這一作 用的機理目前尚未完全闡明。以往用 AK auto Ah作用固定后角質 形成細胞（死細胞）結合對象是角質形成細胞胞漿內的角蛋白，而 且還證實 AK auto Ah對不表達表皮角蛋白的細胞不具此作用，因 此，我們推測 AK auto Ah 進入體外培養(yǎng)細胞（活細胞）胞漿與角 蛋白結合是其發(fā)揮作用的基礎。那么胞外的 AK autoAb是如何與活 細胞胞漿內的角蛋白結合？AK autoAb與角蛋白結合后又發(fā)生了怎 樣的一系列事件而導致了角質形成細胞的增殖抑制？這些問題成為 我們目前關注的焦點。 過去普遍認為，抗體發(fā)揮其生物學活性的區(qū)域僅限于細胞外介 質，而細胞內介質是抗體的禁區(qū)。但近年來大量資料顯示，這種抗 體內化現(xiàn)象廣泛存在。抗體能夠穿透活細胞進入細胞內與細胞核或 2 第四軍醫(yī)大學博士學位論文3 細胞漿內相應抗原結合，干擾細胞功能，引起細胞凋亡或死亡。從 而提示 AK auto Ah 可能也能通過抗體內化進入活細胞與角蛋白結 合而發(fā)揮作用。為了證明這一假設，我們采用免疫酶、共聚焦顯微 鏡和膠體金透射電鏡技術觀察抗角蛋白抗體到底能否進入活細胞以 及在活細胞內的確切定位。并進行基因工程抗角蛋白抗體Fab進入 活細胞觀察，以明確抗角蛋白抗體內化是否依賴于FC受體，初步探 討抗角蛋白抗體內化的跨膜機制。 在此基礎上，我們進一步明確了抗角蛋白抗體對Tea cells的 作用，觀察了抗體作用后角蛋白酪氨酸和 P38MAK磷酸化的變化， 探討了抗角蛋白抗體作用于角蛋白后對細胞功能的影響及作用的機 制。 主要實驗內容和結果： 一、抗角蛋白單克隆抗體進入活細胞的研究及跨膜機制初探 1不同濃度抗角蛋白抗體作用TCa細胞，相同濃度抗角蛋白抗體作用 不同時間。黑素瘤細胞和抗HBsAg抗體作用的Tea細胞作為陰性 對照。固定后用 AK auto Ah作用的k 細胞作為陽性對照。 2 免疫酶、免疫熒光法，Ethidium Homodimer 雙染色。結果顯示抗 角蛋白抗體能夠進入培養(yǎng)的幾 細胞，共聚焦顯微鏡觀察抗角蛋白 抗體能夠進入活凡 細胞胞漿。 3 全屏熒光定量法定量研究進入活Tea 細胞中抗角蛋白單克隆抗 體，表明進入細胞的抗角蛋白單克隆抗體隨著時間的延長濃度升高 而增多，作用時間達到一定程度時，不再增加。 4 基因工程抗人角蛋白Fab也能進入培養(yǎng)的h 細胞。說明抗角蛋 白抗體進入培養(yǎng)h 細胞是不依賴k受體的。 3 第四軍醫(yī)大學博士學位論文4 二、抗角蛋白單克隆抗體對體外培養(yǎng)細胞功能影響及作用機制 IMTT法證明抗角蛋白抗體對n 細胞增殖抑制作用具有時間、劑量 依賴性。 2用抗角蛋白抗體作用的Tea細胞經(jīng)處理后制備成超薄切片。然后用 膠體金作用。結果表明，抗角蛋白抗體
【學位授予單位】：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R751
【圖文】：

抗體培養(yǎng)細胞(活細胞)細胞呈單一著染(x200)

圖6固定細胞(死細胞)用抗體作用呈胞漿、胞核雙染色(x40o)光定量法定量研究進入活Tca細胞中抗角蛋白單克隆抗體70抗角蛋白抗體分別作用Tca細胞30min、lh、Zh、7h、12h。lh一7h內隨著時間增加，熒光強度逐漸增強長時間熒光強度不再增強。下圖7一12是對以上細胞樣本聚焦掃描的結果，下圖13是采用全屏熒光定量法獲得的光強度平均值。

1:70抗角蛋白抗體分別作用Tca細胞30min、lh、Zh、3h、sh、7h、12h。lh一7h內隨著時間增加，熒光強度逐漸增強，以后再延長時間熒光強度不再增強。下圖7一12是對以上細胞樣本相同層面共聚焦掃描的結果，下圖13是采用全屏熒光定量法獲得的細胞樣本熒光強度平均值。

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 劉玉峰,劉彥仿,丁華野,張?zhí)┥?樊平申,廖文俊;AK auto Ah對植入自身表皮作用的動態(tài)觀察[J];第四軍醫(yī)大學學報;1990年06期

2 鞠英,李承新,劉玉峰,王文清,李巍,李志強,趙小東,周淑英;天然抗角蛋白自身抗體IgGF(ab')_2對培養(yǎng)角質形成細胞增殖的影響[J];第四軍醫(yī)大學學報;2000年09期

3 李承新,萬業(yè)宏,劉玉峰,孫林潮;天然抗角蛋白自身抗體對體外培養(yǎng)角質形成細胞細胞周期的影響(英文)[J];第四軍醫(yī)大學學報;2001年05期

4 夏汝山,劉玉峰,李承新,黨育平,萬業(yè)宏,盧濤;同種異體抗角蛋白自身抗體對家兔接觸性皮炎模型IL-6,IL-8的影響[J];第四軍醫(yī)大學學報;2001年15期

5 李巍,劉玉峰,李志強,高天文;抗角蛋白自身抗體對體外表皮形成的影響[J];第四軍醫(yī)大學學報;2001年20期

6 李承新,李巍,劉玉峰,李冰,趙小東,黃慧,高天文;“高效價抗角蛋白自身抗體注射液”的主要藥效學研究[J];第四軍醫(yī)大學學報;2001年24期

7 張?zhí)┥�，李承新，劉玉峰，王�?銀屑病患者鱗屑內AK auto Ab的純化和鑒定[J];第四軍醫(yī)大學學報;1994年02期

8 李承新，劉玉峰，劉彥仿;角蛋白親合層析柱的制備[J];第四軍醫(yī)大學學報;1994年03期

9 李承新,劉玉峰,張?zhí)┥?人血丙種球蛋白治療銀屑病的近、遠期效果觀察及機理初探[J];第四軍醫(yī)大學學報;1996年05期

10 王剛;劉玉峰;;抗角蛋白自身抗體的研究進展[J];國外醫(yī)學.皮膚病學分冊;1992年02期

本文編號：2750897