【摘要】：研究背景 隨著地球臭氧層被破壞,紫外線輻射對(duì)人體健康的損害越來(lái)越受到人們的關(guān)注,日光中的紫外線(UV)是誘發(fā)光老化、光源性損傷包括皮膚腫瘤在內(nèi)的主要因素。UVB導(dǎo)致的DNA損傷主要有包括兩種光產(chǎn)物:嘧啶6-4光產(chǎn)物((6-4)PPs)和環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CPDs),這兩種光產(chǎn)物在正常情況下主要由核苷酸切除修復(fù)(Nucleoutide Excision Removal, NER)途徑進(jìn)行清除和修復(fù),如果此途徑失效,則光產(chǎn)物不能及時(shí)被清除,突變基因被大量復(fù)制,最終將會(huì)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。生物信息學(xué)作為21世紀(jì)自然科學(xué)的核心領(lǐng)域之一,其研究重點(diǎn)主要體現(xiàn)在基因組學(xué)(Genomics)和蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)兩方面,即從核酸和氨基酸序列出發(fā),分析序列中表達(dá)的結(jié)構(gòu)功能的生物信息。近年來(lái),microRNA(miRNA)已經(jīng)逐漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。microRNA是指長(zhǎng)度為21~25個(gè)核苷酸的小型非編碼RNA家族,這些小RNA能夠識(shí)別特定的目標(biāo)miRNA并在轉(zhuǎn)錄后水平呈負(fù)調(diào)控基因的表現(xiàn)。研究表明,作為STATS(signal transducers and activators of transcription)家族的重要一員,STAT3在細(xì)胞增殖、存活、凋亡和炎癥的生物學(xué)過(guò)程中具有重要作用。根據(jù)本課題組前期UVB誘導(dǎo)小鼠皮膚急性光損傷基因芯片的篩選結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn),miRNA146a在UVB輻射后出現(xiàn)顯著下調(diào),推測(cè)其在UVB誘導(dǎo)的急性光損傷中可能具有重要調(diào)控作用。 目的 根據(jù)前期對(duì)UVB誘導(dǎo)急性光損傷后小鼠皮膚中差異表達(dá)的miRNA基因芯片篩選的結(jié)果,進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證及生物信息學(xué)分析,選取miRNA146a作為研究靶點(diǎn),探討UVB照射誘導(dǎo)急性光損傷后miRNA146a在小鼠皮膚及人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)的變化,之后以轉(zhuǎn)染的方法過(guò)表達(dá)miRNA146a,觀察其在HaCaT細(xì)胞中表達(dá)的變化及與JAK/STAT3信號(hào)通路的關(guān)系。 方法 1根據(jù)課題組前期基因芯片篩選結(jié)果,利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)Targetscan預(yù)測(cè)靶基因,Gostat軟件對(duì)其進(jìn)行功能分析,Pathway軟件對(duì)miRNA146a下游靶點(diǎn)基因進(jìn)行分析; 2以C57BL/6小鼠為研究對(duì)象,經(jīng)石蠟脫毛后分為時(shí)效組與量效組:時(shí)效組予UVB180 mJ/cm~2照射,以1、12、24、48h為取材時(shí)間點(diǎn);量效組分別予30、60、90、180及270 mJ/cm2照射,24h后取材。首先運(yùn)用HE染色方法觀察小鼠皮膚組織的病理變化;其次采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)各組皮膚組織中STAT3和磷酸化STAT3的表達(dá);最后以實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組小鼠皮膚中miRNA146a的表達(dá)水平; 3以含10%小牛血清及1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞,miRNA146a-模擬物轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞,過(guò)表達(dá)miRNA146a后,分別以0、30、60、90mJ/cm2UVB照射誘導(dǎo)急性光損傷,MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miRNA146a的表達(dá), western blot技術(shù)檢測(cè)miRNA146a相關(guān)JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中STAT3及p-STAT3的表達(dá)。 結(jié)果 1生物信息學(xué)分析顯示:miRNA-146a參與多種生物學(xué)功能,包括蛋白結(jié)合、發(fā)育進(jìn)程、細(xì)胞分化等方面,traf6,smad4等miRNA146a的靶基因都是參與UVB誘導(dǎo)光損傷天然炎癥免疫的重要基因,另外許多其他未經(jīng)驗(yàn)證的靶點(diǎn)也具有非常重要的意義,由此可見(jiàn):miRNA146a在UVB誘導(dǎo)的急性光損傷中可能具有重要的調(diào)控作用; 2量效組實(shí)驗(yàn)中,HE染色結(jié)果顯示:隨照射劑量增加,小鼠皮膚炎癥反應(yīng)逐漸加重,到270 mJ/cm~2時(shí),小鼠表皮明顯變薄。在時(shí)效組中,照射1h時(shí)炎癥反應(yīng)最重,隨后逐漸減輕。 3免疫組化結(jié)果顯示:隨照射劑量的增加,STAT3表達(dá)逐漸增加,與炎癥反應(yīng)的強(qiáng)弱相關(guān);而在時(shí)效組中,隨著炎癥反應(yīng)逐漸減輕,STAT3表達(dá)也逐漸下調(diào),p-STAT3表達(dá)也呈現(xiàn)類(lèi)似趨勢(shì),但在正常小鼠皮膚中未見(jiàn)其陽(yáng)性表達(dá)。通過(guò)相關(guān)性分析證實(shí)miRNA146a的表達(dá)分別與STAT3和p-STAT3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.92,p0.01;r=-0.981,p0.01); 4 UVB照射后,空白組、30、60、90、180及270 mJ/cm2量效組的miRNA146a表達(dá)水平分別為0.01158±0.00098、0.01083±0.00104、0.00872±0.00031、0.00851±0.00033、0.00810±0.00057、0.00770±0.00031,與UVB的輻射劑量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.83,P0.05);而在時(shí)效組中,180 mJ/cm~2UVB照射1、12、24及48h后miRNA146a表達(dá)水平分別為0.00730±0.00036、0.00805±0.00035、0.00810±0.00057、0.00837±0.00039,各時(shí)效組與對(duì)照組相比,表達(dá)水平均有下調(diào)(P0.05); 5.隨照射劑量增加,STAT3蛋白表達(dá)逐漸增加,而p-STAT3表達(dá)也逐漸增加。使用miRNA146a-mimics上調(diào)內(nèi)源性miRNA146a后,STAT3及p-STAT3蛋白的表達(dá)較普通UVB照射組出現(xiàn)下調(diào);以real-time PCR方法檢測(cè)不同劑量UVB照射后各實(shí)驗(yàn)組中miRNA146a,結(jié)果顯示:各劑量組中miRNA146a的表達(dá)較對(duì)照組而言均出現(xiàn)下調(diào),結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 結(jié)論 C57BL/6小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明:UVB照射可誘導(dǎo)miRNA146a表達(dá)出現(xiàn)下調(diào),而STAT3及p-STAT3蛋白表達(dá)上調(diào);HaCaT細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明:過(guò)表達(dá)miRNA146a可下調(diào)STAT3及p-STAT3蛋白的表達(dá),抑制UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,從而對(duì)細(xì)胞起到光保護(hù)作用。miRNA146a可能通過(guò)JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在UVB誘導(dǎo)的光損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R758.1
【圖文】：

材 料 和 方 法材料 主要儀器）熱混合儀 Eppend）不銹鋼雜交盒 Agil）雜交盒載波片（G2534-60014 型） Agil）雜交烘箱搖床（G2530-60029 型） Agil）納米微粒分光光度計(jì)（ND-1000 型） Thermo Fis）微量離心機(jī) Brinkmann Instrum圖 2.1 UVB 與 JAK/STAT3 信號(hào)通路之間的關(guān)系

180 mJ／cm212h，180 mJ／cm224h，180 mJ／cm2圖 2.3 各實(shí)驗(yàn)組小鼠皮膚中 STAT3 的表達(dá)（IHC×200）表 2.2 不同劑量 UVB 照射小鼠背部皮膚后 STAT3 的表達(dá)（n=3，χ±s）組別 正常組 30mj 60mj 90mj 180mj 270mjstat3 0.321±0.0170.382±0.009 0.409±0.015* 0.548±0.016* 0.649±0.017*0.717±0.00*注：*與正常組比較，p<0.05表 2.3 UVB 照射不同時(shí)間后小鼠背部皮膚 STAT3 的表達(dá)（n=3，χ±s）組別 正常組 1h 12h 24h 48hstat3 0.321±0.017 0.692±0.013* 0.665±0.007* 0.649±0.017* 0.541±0.013*注：*與正常組比較，p<0.05

圖 3.2 miRNA146a-mimics 轉(zhuǎn)染效率觀察（×100） MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活性通過(guò) MTT 法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中的細(xì)胞活性，數(shù)據(jù)列表畫(huà)出折線圖，如圖 3.3示：0h 時(shí)各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組之間的細(xì)胞活性沒(méi)有明顯差異，至 6h 時(shí)各組間差出現(xiàn)，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，組間差異逐漸減小，到 72h 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組及空白之間基本無(wú)明顯差異。

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本文編號(hào)：2747418