【摘要】： 背景: 毛乳頭細胞(dermal papilla cells, DPC)在毛囊形態(tài)發(fā)生、生長周期調(diào)控及維持毛發(fā)生長發(fā)育中起重要作用,并具有在體內(nèi)外條件下重建毛囊的功能。DPC功能的異常變化是導致毛囊周期失衡和脫發(fā)現(xiàn)象的主要起始因素。對DPC生物學功能變化的調(diào)控機制進行深入研究對毛囊生物學和毛發(fā)疾病的研究都有重大的意義。隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展,組織工程皮膚的研究和應用得到長足進展,目前已有多種商品化產(chǎn)品出售并用于臨床。但目前以成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞為種子細胞構(gòu)建的組織工程皮膚沒有毛囊等皮膚附屬器官,在組織結(jié)構(gòu)和功能上與正常皮膚組織仍有較大差異。利用DPC誘導毛囊形成的特性,將其作為種子細胞在組織工程皮膚上重建毛囊,形成含有毛囊結(jié)構(gòu)的人工皮膚替代物,將極大提高創(chuàng)傷愈合的質(zhì)量。但DPC標本不易獲得,其在通常的體外培養(yǎng)條件下經(jīng)過十幾次的傳代后會停止增殖,出現(xiàn)衰老和死亡,且隨著體外培養(yǎng)傳代次數(shù)增多會逐漸失去其固有的一些生物學特性和功能,極大地限制了其研究和應用。 建立永生化細胞系是解決體外培養(yǎng)條件下細胞衰老的一種常用手段。然而,以往建立細胞系的方法大多是通過轉(zhuǎn)染病毒基因或癌基因誘導細胞永生化,通過這些方法建立的細胞系有許多局限性:其基因整合是隨機性的,轉(zhuǎn)染獲得的是轉(zhuǎn)化細胞而非正常細胞,其表型、核型等可發(fā)生改變。且有的轉(zhuǎn)化細胞系僅通過了M1期,壽命延長,而并非永生化。研究表明,端粒酶的激活可以延緩細胞衰老,甚至使細胞永生化。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)作為端粒酶的催化亞單位和限速酶,在端粒酶活性維持中起關(guān)鍵作用。將外源性hTERT基因轉(zhuǎn)入目的細胞,可誘導細胞端粒酶活性,使細胞永生化。hTERT介導的永生化細胞系保留了更多正常細胞的生物學特征。另外,hTERT介導的永生化細胞系已逾越M2期,同胚胎干細胞一樣,是真正意義上的永生化。為此,本研究將外源性hTERT基因?qū)塍w外培養(yǎng)的正常人DPC,擬建立永生化人DPC系,并進一步分析該細胞系的生物學和功能學特征,以期為DPC的基礎(chǔ)研究和臨床應用提供充足的、穩(wěn)定的和正常的細胞來源。 目的: 1.建立永生化人DPC系。 2.觀察體外培養(yǎng)條件下該細胞系的生物學和功能學特征。 3.觀察該細胞系在體內(nèi)誘導毛囊形成的能力。 方法: 1.采用我科建立的“酶消化法”分離培養(yǎng)正常人DPC,觀察體外培養(yǎng)DPC形態(tài)和生長情況并行α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)免疫組化染色鑒定。 2.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,將空載體質(zhì)粒pIRES2-EGFP和含有hTERT基因的質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hTERT分別導入體外培養(yǎng)的第3代正常人DPC,經(jīng)G418篩選得到陽性克隆,連續(xù)傳代培養(yǎng)。分別采用PCR和RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)hTERT基因的整合與表達,采用端粒酶重復序列擴增(TRAP)-ELISA法檢測轉(zhuǎn)染細胞的端粒酶活性。 3.取轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hTERT第30代DPC,在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長情況,采用免疫組化檢測α-SMA在細胞內(nèi)的表達,采用細胞生長曲線分析和細胞周期測定觀察細胞的增殖特征,采用染色體核型分析、軟瓊脂克隆形成實驗和裸鼠致瘤實驗觀察細胞的轉(zhuǎn)化特征,采用ELISA法檢測培養(yǎng)上清中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)濃度觀察細胞的分泌功能。 4.將轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hTERT第30代DPC與剛分離的毛囊上皮細胞混合后直接注射到裸鼠背部皮下觀察其在體內(nèi)誘導毛囊形成的能力。 結(jié)果: 1.采用我科建立的“酶消化法”分離培養(yǎng)了正常人DPC,體外培養(yǎng)的DPC形態(tài)上類似成纖維細胞,單個細胞的形態(tài)呈梭形,體積較大,具有明顯的多層凝集性生長特性,表達體外培養(yǎng)DPC的特異性標記物α-SMA。 2.利用陽離子脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)染技術(shù),將空載體質(zhì)粒pIRES2-EGFP和含有hTERT基因的質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hTERT分別導入體外培養(yǎng)的正常人DPC,經(jīng)G418篩選3周后轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒pIRES2-EGFP組和質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hTERT組各出現(xiàn)1個陽性細胞克隆,分別命名為DPC-EGFP和DPC-hTERT。濾紙片法將細胞克隆移至24孔板擴大培養(yǎng)后DPC-EGFP細胞生長增殖能力較差,傳至12代后細胞發(fā)生衰老、死亡。而DPC-hTERT細胞擴大培養(yǎng)后生長良好,增殖能力強,現(xiàn)已連續(xù)傳至65代,傳代中細胞生長增殖速度無明顯變化。檢測發(fā)現(xiàn)DPC和DPC-EGFP細胞無hTERT基因的整合與表達,端粒酶活性為陰性;而DPC-hTERT細胞穩(wěn)定整合與表達hTERT,同時端粒酶活性轉(zhuǎn)為陽性。 3. DPC-hTERT形態(tài)和生長特性與低代DPC基本相同,α-SMA免疫組化染色陽性,生長增殖活躍,無明顯轉(zhuǎn)化特征,染色體核型正常,在軟瓊脂內(nèi)不能生長,無裸鼠致瘤性,具有正常DPC的分泌功能。 4. DPC-hTERT與剛分離的毛囊上皮細胞混合后注射到裸鼠背部皮下能誘導內(nèi)含較多細胞和色素顆粒的表皮囊腫結(jié)構(gòu)形成。 結(jié)論: 1.我們利用陽離子脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)染技術(shù),將外源性hTERT基因?qū)塍w外培養(yǎng)的正常人DPC,成功地建立了永生化人DPC系DPC-hTERT。 2. DPC-hTERT基本上是正常細胞而無明顯轉(zhuǎn)化特征,保持了正常人DPC的生物學和功能學特征�？赏麨樯钊胙芯緿PC生物學功能變化的調(diào)控機制提供理想的細胞模型,為構(gòu)建含有毛囊等附件的全功能組織工程皮膚提供充足的種子細胞。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R751
【圖文】：

圖 1-2 質(zhì)粒 pIRES2-EGFP-hTERT 測序結(jié)果 (第一部分)CAAAAGAGTGGTTAGTGAACGTCAGAGCATAACGTGCTACCGGGATAAGCTAGCTAAGCTTCGAATTACCACCATGCCGCGCGCTCCCCGCTGCCGAGCCGCTCCCTGCTGCGCAGCCACTACCGCGAGGTGCTGCCGCTGGCCACGTTCGGCGCCTGGGGCCCCAGGGCTGGCGGCTGGTGCAGCGCGGGGACCCGGCTTCCGCGCGCTGGTGGCCCAGTGCCTGGTGTGCGTGCCCTGGGACGCACGCCCCCCGCCGCCCCCTCCTTCCGCCAGGTGTCCTGCCTGAAGGAGCTGGTCGAGTGCTGCAGAGGCTGTGCGAGCGCGGCGCGAAGAACGTGCTGGCCTCTTCGCGCTGCTGGACGGGGCCCGCGGGGGCCCCCCCGAGGCCTTCACCACGTGCGCAGCTACCTGCCCAACACGGTGACCGACGCACTGCGGGGGAGCCGTGGGGGCTGCTGCTGCGCCGCGTGGGCGACGACGTGCTGGTTCACCTGCACGCTGCGCGCTCTTTGTGCTGGTGGCTCCCAGCTGCGCCTACCAGGTGT

細胞生長較快，向四周呈放射狀生長(圖 1-4)，此時毛乳頭逐漸失的形狀，形成成片的細胞生長致密區(qū)。培養(yǎng)的 DPC 在散開 10 d ~ 14 d 后又融合，融合后細胞大致仍由呈放射狀排列的多個細胞團組成，中央?yún)^(qū)細胞出并向上堆積，呈凝集性生長。凝集性生長初期的 DPC 多呈多角形或長三角是凝集團中央?yún)^(qū)的細胞，周邊區(qū)細胞則多呈梭形，形態(tài)類似成纖維細胞，但較大。經(jīng)胰酶消化并傳代的 DPC，可在 2 h 內(nèi)貼壁并鋪開生長。細胞排列方式開則，隨著細胞數(shù)目增多，DPC 逐漸重新傾向凝集性生長(圖 1-5)。隨著時間凝集性生長現(xiàn)象逐漸明顯，如果不給予傳代干預，則向上堆積成細胞球。培 一般 7 d 后開始逐漸融合，凝集成團的 DPC 可以形成類似最初分離出的而，隨著 DPC 傳代次數(shù)增加，凝集性生長現(xiàn)象逐漸消失，7 代以后的 D再出現(xiàn)凝集性生長現(xiàn)象(圖 1-6)。

【參考文獻】

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本文編號：2742284