【摘要】：[背景]銀屑病是一種多基因共同參與的復(fù)雜疾病,在多種誘發(fā)因素如外傷、感染或藥物等刺激下,于易感個體中出現(xiàn)銀屑病表型。特征性的皮損表現(xiàn)為境界清楚、覆有白色鱗屑的紅斑、斑塊,病理表現(xiàn)為表皮角化過度、角化不全、棘層肥厚、真皮血管擴張和淋巴細(xì)胞為主的炎性浸潤。銀屑病患者常伴有系統(tǒng)性疾病如高血壓、糖尿病、冠心病、肥胖及代謝綜合征等,且銀屑病病程漫長、反復(fù)發(fā)作,是嚴(yán)重影響患者身心健康和生活質(zhì)量的復(fù)雜皮膚疾病。因此對銀屑病發(fā)病機制的研究十分重要且刻不容緩。免疫發(fā)病機制在銀屑病發(fā)病中占有重要地位,也是近年來指導(dǎo)銀屑病治療的重要基礎(chǔ),其中以IL-23/T17軸為中心的固有免疫到適應(yīng)性免疫炎癥信號環(huán)路是研究的主要方向,與其相關(guān)的蛋白分子一直受到關(guān)注。SPRY1蛋白屬于SPRY蛋白家族,是一種富含半胱氨酸的蛋白,具有多個結(jié)構(gòu)功能域,包括C-端富含半胱氨酸的功能域,Raf1結(jié)合功能域以及一個高度保守的N-端功能域。既往的研究明確了SPRY1對RTK信號通路負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用,并參與到多種疾病及生理過程中。我們前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPRY1過表達對角質(zhì)形成細(xì)胞具有抑制增殖、促進凋亡及影響分化的作用,并且在銀屑病患者及正常人間存在差異表達,但SPRY1在銀屑病發(fā)病機制中的具體作用如何,是否參與了銀屑病固有免疫發(fā)病機制以及其可能的作用,都尚未有深入的研究。因此,在本論文中我們將深入探討SPRY1對銀屑病發(fā)病機制尤其是固有免疫的影響及機制研究。[目的]明確SPRY1在銀屑病及正常人皮膚、角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達差異;明確SPRY1與皮膚屏障功能、固有免疫相關(guān)基因、銀屑病相關(guān)炎癥因子以及角質(zhì)形成細(xì)胞生物學(xué)功能之間的相關(guān)性;通過K14-SPRY1小鼠模型的研究,闡明SPRY1在皮膚屏障、抗菌肽改變及固有免疫中的功能;通過K14-SPRY1條件性過表達小鼠,發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷、感染等誘發(fā)銀屑病表型產(chǎn)生的新機制,并以此為基礎(chǔ)進一步發(fā)現(xiàn)銀屑病治療的新靶標(biāo)。[方法]以免疫組化及免疫熒光明確SPRY1在正常人皮膚及角質(zhì)形成細(xì)胞中的定位及表達;分離培養(yǎng)正常人角質(zhì)形成細(xì)胞,WB及qRT-PCR法檢測SPRY1與細(xì)胞分化相關(guān)性;免疫組化及免疫熒光檢測銀屑病、濕疹、結(jié)節(jié)性癢疹患者皮損中SPRY1的表達及定位,RNAseq、qTR-PCR、WB法明確SPRY1在銀屑病患者皮損區(qū)角質(zhì)形成細(xì)胞與正常人角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達差異;將LPS、Poly I:C、雙氧水及炎癥因子(IL-6、IL-17A、IL-23、TNFα)及銀屑病治療藥物(氯倍他索、MTX、卡泊三醇、阿維A)與體外培養(yǎng)的正常人及銀屑病患者皮損區(qū)角質(zhì)形成細(xì)胞共孵育,以WB及qRT-PCR法比較以上處理因素對SPRY1在相應(yīng)角質(zhì)形成細(xì)胞中表達的影響;以免疫熒光檢測S P RY1與抗菌肽L L 3 7在正常人及銀屑病患者組織及銀屑病患者鄰近皮損區(qū)角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達與定位;重組人LL37處理正常人角質(zhì)形成細(xì)胞,以WB及qRT-PCR法檢測處理后SPRY1表達的改變;以免疫共沉淀及質(zhì)譜分析檢測SPRY1可能相互作用的蛋白;以WB及qRT-PCR法檢測SPRY 1轉(zhuǎn)基因小鼠與WT小鼠表皮中表皮屏障、分化、增殖、凋亡等相關(guān)蛋白和基因的表達差異;構(gòu)建小鼠創(chuàng)傷模型,通過Masson三色染色、免疫組化及WB比較SPRY1轉(zhuǎn)基因小鼠與WT小鼠創(chuàng)傷愈合過程中的差異;以IMQ構(gòu)建小鼠銀屑病模型,通過皮損區(qū)HE染色比較表皮厚度、真皮血管數(shù)量,免疫熒光及qRT-PCR比較造模后SPRY1的表達差異,qRT-PCR及ELISA方法比較炎癥因子、表皮屏障、固有免疫等相關(guān)基因及蛋白的改變;以流式細(xì)胞技術(shù)檢測造模后真皮、皮膚引流淋巴結(jié)及外周血中炎癥細(xì)胞的改變。[結(jié)果]1、SPRY1連續(xù)表達于人皮膚顆粒層,參與角質(zhì)形成細(xì)胞晚期分化;2、在銀屑病患者皮損區(qū)SPRY1表達減少或缺失,藥物治療后的皮損區(qū)SPRY1表達恢復(fù);3、LPS、Poly I:C、H2O2及銀屑病相關(guān)炎癥因子抑制正常人角質(zhì)形成細(xì)胞SPRY1的表達;氯倍他索、MTX、卡泊三醇及阿維A可促進銀屑病皮損區(qū)角質(zhì)形成細(xì)胞SPRY1的表達;4、抗菌肽LL37抑制正常人角質(zhì)形成細(xì)胞中SPRY1表達;5、過表達SPRY1可促進C57BL/6小鼠皮膚中表皮角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡、抑制表皮增殖,影響表皮分化。6、表皮特異性地過表達SPRY1延遲C57BL/6小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合,影響創(chuàng)緣肉芽組織成熟機化,抑制增生表皮的爬行;7、過表達SPRY1減輕IMQ誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠銀屑病樣皮炎表型,影響表皮屏障、固有免疫相關(guān)基因的表達,此外還抑制了小鼠真皮中IL-17A+γδT細(xì)胞增加及moDCs的聚集。[結(jié)論]SPRY1在銀屑病患者皮損區(qū)組織中及分離培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞中表達減少或缺失;SPRY1抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、促進凋亡、影響晚期分化;正常人角質(zhì)形成細(xì)胞受感染、損傷或炎癥因子刺激后SPYR1表達降低;銀屑病皮損區(qū)皮膚及角質(zhì)形成細(xì)胞經(jīng)藥物治療后SPRY1隨皮損改善而表達恢復(fù);表皮特異性過表達SPRY1影響小鼠皮膚創(chuàng)傷的愈合;表皮特異性過表達SPRY1減輕IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮炎。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R758.63
【圖文】：

能發(fā)揮相互補償?shù)淖饔�。ＳＰＲＹ１蛋白具有多個結(jié)構(gòu)功能域，包括Ｃ－端富含半胱氨逡逑酸的功能域，Ｒａｆｌ結(jié)合功能域，一個高度保守的Ｎ－端功能域Ｍｌ。ＳＰＲＹ逡逑是受體酪氨酸激酶（ＲＴＫ）的負(fù)反饋抑制劑（圖１．４），ＳＰＲＹ１可負(fù)性調(diào)控生長因子誘逡逑導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移和分化［２ａ２１］，通過激活ＮＦｋＢ信號途徑誘導(dǎo)衰老相關(guān)表型［２１］，逡逑而ＮＦｋＢ信號途徑許多相關(guān)基因均與固有免疫有關(guān)［２２１。逡逑有研究發(fā)現(xiàn)Ｓｐｒｏｕｔｙ邋１是唯一的可由激活的小鼠ＣＤ４＋Ｔ細(xì)胞受體誘導(dǎo)的Ｓｐｒｏｕｔｙ逡逑亞型，并且與ＴＣＲ信號通路共刺激相關(guān)的Ｓｐｒｏｕｔｙｌ表達依賴于細(xì)胞分化的狀態(tài)［２３】。逡逑與之相比，在小鼠脾臟中的Ｂ細(xì)胞，則為ｓｐｒｏｕｔｙ２而非ｓｐｒｏｕｔｙｌ與其ＢＣＲ相互作用，逡逑以負(fù)反饋調(diào)節(jié)的方式抑制ＥＲＫ通路激活，進而表明其參與Ｂ細(xì)胞的成熟分化［２４］。在逡逑類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑膜細(xì)胞及組織中存在ｍｉＲ－３３８－５ｐ高表達，當(dāng)成纖維樣滑膜細(xì)胞逡逑中高表達ｍｉＲ－３３８－５ｐ后，可直接沉默Ｓｐｒｏｕｔｙｌ的ｍＲＮＡ３’ＵＴＲ，下調(diào)Ｓｐｒｏｕｔｙｌ蛋白逡逑４逡逑

邋Ｉ：－逡逑Ｍｅｔｔｅ邋Ｄ．Ｈａｚｅｎｂｅｒｇ．邋Ｂｌｏｏｄ．邋２０１４．邋１２４：邋７００－７０９逡逑圖１．３人ＩＬＣｓ參與正常、特性應(yīng)皮炎及銀屑病的不同分類。逡逑Ｓｐｒｏｕｔｙ（ＳＰＲＹ）蛋白是１９９８年發(fā)現(xiàn)的Ｒａｓ／ＭＡＰ激酶信號鏈特異性抑制蛋逡逑白［１７］，隨后在哺乳動物中也發(fā)現(xiàn)其類似物，分別命名為ＳＰＲＹ１－４［１８ＬＳＰＲＹ１蛋白是逡逑一種富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，在血管新生中發(fā)揮重要的作用。人類ＳＰＲＹ蛋白各個逡逑組分的表達在不同的人體組織中有所不同。ＳＰＲＹ１，２和４在胚胎各期及成人組逡逑織中廣泛表達，而ＳＰＲＹ３僅表達于成人的腦和睪丸組織。各個ＳＰＲＹ俎分之間并不逡逑能發(fā)揮相互補償?shù)淖饔�。ＳＰＲＹ１蛋白具有多個結(jié)構(gòu)功能域，包括Ｃ－端富含半胱氨逡逑酸的功能域，Ｒａｆｌ結(jié)合功能域，一個高度保守的Ｎ－端功能域Ｍｌ。ＳＰＲＹ逡逑是受體酪氨酸激酶（ＲＴＫ）的負(fù)反饋抑制劑（圖１．４），ＳＰＲＹ１可負(fù)性調(diào)控生長因子誘逡逑導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移和分化［２ａ２１］

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本文編號：2740717