【摘要】：研究背景 銀屑病(psoriasis)是一種常見(jiàn)的以紅斑鱗屑為特點(diǎn)的慢性炎癥性皮膚病,中醫(yī)稱(chēng)為白疙、松皮癬。中醫(yī)認(rèn)為本病是由素體營(yíng)血虧虛,化燥生風(fēng),肌膚失養(yǎng)而成,急性期以血熱生風(fēng)為主,慢性期以血虛生風(fēng)為主,導(dǎo)致肌膚失于濡養(yǎng)而發(fā)病。銀屑病是一種細(xì)胞免疫異常而導(dǎo)致的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增生與炎癥反應(yīng)共存的慢性疾病,其病理變化以表皮角化過(guò)度及角化不全、棘層增厚、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)如樹(shù)突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等以及血管異常增生為特征。迄今為止,銀屑病的發(fā)病機(jī)制尚不明確,仍缺乏長(zhǎng)期根治的方法,因此其發(fā)病機(jī)制及治療方法的探索一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。 T細(xì)胞活化在銀屑病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。近年來(lái),輔助性T細(xì)胞17(Th17)介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路異常激活在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中的作用引起了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注,彌補(bǔ)了傳統(tǒng)上認(rèn)為銀屑病是由Thl/Th2介導(dǎo)的免疫炎癥性疾病的不足。在疾病狀態(tài)下,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)被激活后,與前炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)共同調(diào)控Th17細(xì)胞的分化和功能,從而不斷加劇由白細(xì)胞介素-23/輔助性T細(xì)胞17(IL-23/Th17)作用軸所介導(dǎo)的皮膚炎癥反應(yīng)。研究表明,銀屑病患者的皮疹及血漿中TGF-β1、IL-6、IL-23以及IL-17的表達(dá)水平明顯升高,TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路高度激活,表皮角質(zhì)形成細(xì)胞持續(xù)增生。這些研究表明在銀屑病發(fā)病機(jī)制中,TGF-β1、IL-6與Th17細(xì)胞可能密切相關(guān)。 TGF-β1是一種多功能的細(xì)胞因子,調(diào)節(jié)不同的生理和病理過(guò)程。TGF-β1在T細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。研究表明,缺乏TGF-β1時(shí)初始CD4+T細(xì)胞不能向Thl7細(xì)胞分化。相反,在角蛋白5(K5)基因啟動(dòng)子驅(qū)使下,小鼠表皮角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度表達(dá)TGF-β1,表現(xiàn)出與銀屑病患者具有強(qiáng)烈相似性的皮膚外觀,從而成為目前世界公認(rèn)的轉(zhuǎn)基因銀屑病小鼠模型之一——K5.TGFβ1轉(zhuǎn)基因小鼠(角蛋白5-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1轉(zhuǎn)基因小鼠)。這一發(fā)現(xiàn)表明TGF-β1在銀屑病中可能具有致病作用,但是其致病的分子機(jī)制目前尚未明確。TGF-β1與受體結(jié)合后,激活下游信號(hào)分子Smad2和Smad3,從而調(diào)節(jié)其生物活性。其中Smad3被普遍認(rèn)為在免疫應(yīng)答及纖維化反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,而Smad2的作用與Smad3相反。 根據(jù)Smad3在某些炎癥性及纖維化疾病中的重要致病作用,著眼于研究Smad3可能為銀屑病的治療方法提供新思路。在本項(xiàng)課題中,我們假設(shè)阻斷TGF-β/Smad信號(hào)的過(guò)度激活,抑制TGF-β與IL-6共同調(diào)控的Th17信號(hào)通路,從而對(duì)銀屑病模型小鼠發(fā)揮治療作用。由于Smad3在決定轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)起關(guān)鍵作用,本研究使用一種Smad3的特異性抑制劑——Smad3抑制劑來(lái)觀察對(duì)TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病皮疹的治療作用。Smad3抑制劑已被證實(shí)能特異性抑制Smad3磷酸化。 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子p (transforming growth factor, TGFβ):TGFβ是一類(lèi)多功能的細(xì)胞因子,由多種組織細(xì)胞合成,調(diào)控著細(xì)胞周期,影響細(xì)胞的增殖、分化、黏附、轉(zhuǎn)移和凋亡,與人類(lèi)多種疾病密切相關(guān)。TGFβ通過(guò)TGFβ/Smad信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。TGF-β1促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng),并在T細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。 Smad3:Smad3是Smads蛋白家族成員之一。Smads家族蛋白是一類(lèi)新發(fā)現(xiàn)的TGF-β信號(hào)的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)介導(dǎo)者,在將TGF-β信號(hào)從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用。TGF-β作為配體形成的受體復(fù)合物,激活Smads進(jìn)入核內(nèi),共同激活或抑制它們調(diào)節(jié)的靶基因的轉(zhuǎn)錄。Smad3已被證實(shí)在炎癥和纖維化反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 白細(xì)胞介素-17(白介素-17,Interleukin-17, IL-17):白細(xì)胞介素-17是一個(gè)重要的促炎癥細(xì)胞因子,由輔助性T細(xì)胞(Th17)及先天性免疫細(xì)胞等分泌,在多種炎性反應(yīng)及自身免疫性疾病病理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)IL-17在多種自身免疫疾病如多發(fā)性硬化,類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,銀屑病患者的特定病理組織中,其表達(dá)顯著上調(diào)。 白細(xì)胞介素-6(白介素-6,Interleukin-6, IL-6):IL-6是一種促炎和多效性的細(xì)胞因子,可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化,具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)及造血功能,并在機(jī)體的抗感染免疫反應(yīng)中起重要作用。由角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生,參與真皮和表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。 白細(xì)胞介素-23(白介素-23,Interleukin-23, IL-23):IL-23可作用于活化T細(xì)胞、記憶性T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞,在炎癥性疾病、自身免疫性疾病的發(fā)病以及抗腫瘤和抗感染等方面發(fā)揮重要作用。IL-23刺激Th17的擴(kuò)增和維持,研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者在皮膚損害處IL-23p19和p40mRNA的水平顯著增高。 研究目的和意義 本項(xiàng)研究旨在通過(guò)觀察Smad3抑制劑對(duì)銀屑病模型小鼠皮膚組織中各纖維化和炎癥細(xì)胞因子的蛋白和mRNA表達(dá)水平的影響,分析Smad3抑制劑對(duì)銀屑病轉(zhuǎn)基因小鼠中TGF-β/Smad所調(diào)控的皮膚纖維化的作用及分子機(jī)制以及Th17所介導(dǎo)的皮膚炎癥的作用及分子機(jī)制。研究Smad3抑制劑對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病皮損的治療作用,旨在從分子水平上闡述Smad3在銀屑病中潛在的致病作用,為銀屑病的發(fā)病機(jī)制、治療方法提供新思路和理論支持,并為研究目前已被證實(shí)具有Smad3抑制劑相同作用的中藥對(duì)銀屑病的治療作用及分子機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù),降低單純運(yùn)用西藥治療銀屑病所引起的不良反應(yīng),從分子水平上探索中西醫(yī)結(jié)合治療銀屑病的新方法,更好地指導(dǎo)臨床和科研。 研究方法 1.K5-TGFβ1轉(zhuǎn)基因小鼠(角蛋白5-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1轉(zhuǎn)基因小鼠)及正常小鼠,適應(yīng)性飼養(yǎng)12周后用于本項(xiàng)研究。TGFβ1野生型(TGFβ1WT)小鼠不表現(xiàn)疾病狀態(tài),為正常小鼠對(duì)照。同窩TGFβ1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分配到疾病對(duì)照組、空白對(duì)照組及Smad3抑制劑治療組,同窩TGFβ1野生型小鼠作為正常小鼠對(duì)照,每組各6只。 2.Smad3抑制劑溶解于DMSO,并制作成藥膏。疾病對(duì)照組及正常小鼠對(duì)照組不作干預(yù),空白對(duì)照組使用不含Smad3抑制劑的藥膏,治療組使用含有Smad3抑制劑(5ug/ml)的藥膏。藥膏用于轉(zhuǎn)基因小鼠的皮疹,每日2次,連續(xù)使用2個(gè)月。 3.在治療前及治療期間每隔2周使用國(guó)際上針對(duì)銀屑病轉(zhuǎn)基因小鼠疾病嚴(yán)重程度所建立的評(píng)分系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠的皮損進(jìn)行評(píng)分,同時(shí)用標(biāo)尺測(cè)量轉(zhuǎn)基因小鼠及正常小鼠皮膚厚度的變化。 4.藥膏使用2個(gè)月后,收集各組小鼠的血漿及皮膚組織,常規(guī)處理后,進(jìn)行石蠟包埋、切片以及提取皮膚組織蛋白及RNA,以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。 5.應(yīng)用蘇木素及伊紅染色(HE)評(píng)估小鼠皮膚的組織學(xué)改變。 6.馬松三色染色評(píng)估小鼠皮膚膠原纖維沉積的變化。 7.免疫組織化學(xué)技術(shù)(IHC)及蛋白質(zhì)免疫印記法(western blot)檢測(cè)小鼠皮膚組織中各細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)水平。 8.免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)免疫細(xì)胞的數(shù)量。 9.逆轉(zhuǎn)錄(RT)聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)檢測(cè)小鼠皮膚組織中目的基因的mRNA表達(dá)水平。 10.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Elisa)檢測(cè)小鼠血漿中各細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)水平。 11.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。本項(xiàng)研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,均數(shù)間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA/NK法),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究過(guò)程及結(jié)果 1.為確定Smad3抑制劑安全有效的劑量用于本項(xiàng)研究,設(shè)計(jì)3個(gè)含有不同濃度Smad3抑制劑(低劑量、中劑量及高劑量)的藥膏——分別為2.5,5,10μg/ml(重量／體積),與不含Smad3抑制劑的空白對(duì)照藥膏分別應(yīng)用于TGFβ1轉(zhuǎn)基因小鼠(每組3只)的皮膚病灶3個(gè)月,每日2次。根據(jù)組織學(xué)改變、膠原纖維沉積程度、小鼠疾病嚴(yán)重程度評(píng)分、小鼠皮膚厚度以及真皮組織中CD3陽(yáng)性T細(xì)胞及F4/80陽(yáng)性巨噬細(xì)胞的數(shù)量,提示5μg/ml的Smad3抑制劑藥膏對(duì)銀屑病轉(zhuǎn)基因小鼠具有最佳治療作用。這種作用體現(xiàn)在治療1個(gè)月后皮膚病灶明顯改善并在3個(gè)月的治療時(shí)期內(nèi)持續(xù)抑制疾病進(jìn)展。3個(gè)劑量的Smad3抑制劑藥膏同時(shí)應(yīng)用于正常小鼠,其余處理因素相同,其組織學(xué)特點(diǎn)、炎癥因子、膠原纖維沉積以及血清乳酸脫氫酶水平均表明最高劑量的Smad3抑制劑(10μg/ml)沒(méi)有毒性。因此,本項(xiàng)研究中5μg/ml的Smad3抑制劑安全有效,應(yīng)用于每組6只的TGFβ1轉(zhuǎn)基因小鼠,每日2次,連續(xù)治療2個(gè)月(平均有效時(shí)間)。與同年齡正常小鼠相比,疾病對(duì)照組及空白對(duì)照組的轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚演變?yōu)榈湫偷你y屑病樣皮損,即紅斑、增厚的皮膚上覆蓋銀白色鱗屑。Smad3抑制劑治療的TGFβ1轉(zhuǎn)基因小鼠,其疾病嚴(yán)重程度評(píng)分(F=4.413,P0.05),表皮厚度(F=24.57,P0.01),皮膚雙褶厚度變化(F=8.423,P0.05)表皮與真皮中浸潤(rùn)的CD3陽(yáng)性T細(xì)胞(F=19.18,P0.05)及F4/80陽(yáng)性巨噬細(xì)胞(F=22.35,P0.01)；馬松三色染色法(F=16.01,P0.01)及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的免疫組織化學(xué)檢測(cè)(F=32.23,P0.01)膠原纖維沉積與空白對(duì)照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示Smad3抑制劑可有效減輕銀屑病轉(zhuǎn)基因小鼠的炎癥反應(yīng)及膠原沉積。疾病對(duì)照組與空白對(duì)照組比較,上述指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.進(jìn)一步檢測(cè)Smad3抑制劑減緩TGFβ1轉(zhuǎn)基因小鼠疾病進(jìn)展所潛在的分子生物學(xué)機(jī)制。首先Smad3抑制劑是否通過(guò)阻斷TGF-β/Smad3信號(hào)從而對(duì)TGFβ1轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病樣皮損起治療作用。Smad3抑制劑治療的TGFβ1轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚組織中TGFβ1的蛋白(F=36.74, P0.01)、mRNA (F=8.891, P0.05)表達(dá)水平及血漿中TGFβ1的蛋白(F=34.07,P0.05)表達(dá)水平與空白對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；免疫組織化學(xué)技術(shù)(F=21.88,P0.05)及免疫印記法(F=15.05,P0.05)檢測(cè)TGFβ下游的信號(hào)分子蛋白Smad3磷酸化水平與空白對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示Smad3抑制劑通過(guò)抑制TGF-β/Smad3信號(hào)通路對(duì)銀屑病起治療作用。疾病對(duì)照組與空白對(duì)照組比較,上述指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.進(jìn)一步檢測(cè)在阻斷TGFβ/Smad3的同時(shí),Smad3抑制劑是否阻斷Th17炎癥信號(hào)通路,從而抑制TGFβ1轉(zhuǎn)基因小鼠的疾病進(jìn)展。Smad3抑制劑治療的TGFβ1轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚組織中IL-6(F=6.397, P0.05). IL-23(F=4.921, P 0.05、IL-17A(F=7.583,P0.05)的mRNA表達(dá)水平及血漿中IL-6(F=5.119, P0.05)、IL-23(F=5.402, P0.05)、IL-17A (F=7.046, P0.05)的蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TGFβ1轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚病灶中CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞,即CD4與IL-17A雙陽(yáng)性的Th17細(xì)胞經(jīng)Smad3抑制劑治療后其數(shù)量明顯減少(F=5.644,P0.05),與空白對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Th17的轉(zhuǎn)錄因子——維A酸相關(guān)孤獨(dú)受體yt (RORyt)在Smad3抑制劑治療后其表達(dá)水平((F=5.154,P0.05)明顯下降,與空白對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果提示Smad3抑制劑對(duì)IL-23/Th17作用軸具有抑制作用,從而減輕TGFβ1轉(zhuǎn)基因小鼠的炎癥反應(yīng)。疾病對(duì)照組與空白對(duì)照組比較,上述指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 討論 本項(xiàng)研究為Smad3抑制劑作為銀屑病一種新型的具有治療潛力的治劑提供理論依據(jù)。Smad3抑制劑可以有效降低銀屑病皮膚組織膠原纖維沉積及TGFβ1的過(guò)度表達(dá),抑制Smad3磷酸化水平的上調(diào),有效改善體內(nèi)IL-6、IL-17A、 IL-23細(xì)胞因子含量,減少Th17細(xì)胞的過(guò)度分化,降低炎癥反應(yīng),從而對(duì)銀屑病起治療作用。研究結(jié)果表明TGFβ/Smad3信號(hào)通路可能是對(duì)銀屑病進(jìn)行有效治療的新靶向,具有創(chuàng)新性。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)抑制TGFβ/Smad3信號(hào)通路及IL-23/Th17炎癥信號(hào)通路是Smad3抑制劑有效阻斷K5.TGFβ1轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病樣皮損進(jìn)展的分子機(jī)制。著眼于TGFβ/Smad3信號(hào)通路及IL-23/Th17炎癥信號(hào)通路將為銀屑病的發(fā)病機(jī)制及治療方法提供新思路。 科研工作來(lái)源 本項(xiàng)研究來(lái)源于自選課題,為南方醫(yī)科大學(xué)及香港中文大學(xué)合作項(xiàng)目,于香港中文大學(xué)李嘉誠(chéng)健康科學(xué)研究所進(jìn)行科學(xué)研究,課題基金來(lái)源于香港研究資助局(RGC),基金編號(hào)：RGC GRF469110,及CUHK3/CRF/12R。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R758.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2737420