【摘要】： 研究目的和意義:支原體是迄今所知能夠自我復(fù)制并獨(dú)立存活的最小原核細(xì)胞型微生物,種類繁多。支原體廣泛存在于人類、動(dòng)物、植物。目前研究發(fā)現(xiàn),女性生殖道中的支原體分離率非常高,研究者陸續(xù)在女性泌尿生殖道分離出解脲支原體(Uu)、人型支原體(Mh)、生殖支原體(Mg)、穿通支原體(Mpe)、發(fā)酵支原體(Mf)、梨支原體(Mpi)。這6種支原體目前被認(rèn)為與許多生殖泌尿系統(tǒng)疾病相關(guān)聯(lián)。近幾年來,對(duì)支原體感染的研究越來越受到重視,國(guó)內(nèi)外關(guān)于支原體有大量的文獻(xiàn)報(bào)道。但是關(guān)于支原體致病性的流行病學(xué)調(diào)查有著不同的結(jié)論,探討從女性下生殖道中分離出的支原體是否具有致病性、是否需要治療具有重要的臨床指導(dǎo)意義。 有研究認(rèn)為,支原體為人體條件致病菌,寄居于人體特定器官,通常只有在機(jī)體免疫力低下或者局部微環(huán)境改變的條件下才會(huì)引起疾病;有的研究則認(rèn)為,只有特定的某種或某些類型的支原體對(duì)人體才有致病作用,或者是說某種支原體會(huì)導(dǎo)致某類疾病的發(fā)生。對(duì)于支原體的流行病學(xué)情況,目前仍是一個(gè)有待于研究解決的問題。自上世紀(jì)80年代未,分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用使支原體的研究取得了很大進(jìn)展,支原體的檢出率、檢測(cè)準(zhǔn)確性大為提高,為臨床診斷和治療提供了有力的依據(jù)。利用rDNA序列對(duì)支原體進(jìn)行分型,是此領(lǐng)域的重要進(jìn)展,近年來已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。可以預(yù)見,對(duì)生殖道支原體的分子基因檢測(cè)及分型,將為全面而深入地理解泌尿生殖道支原體的多樣性奠定基礎(chǔ)。 本研究應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù),建立支原體的16SrDNA克隆文庫進(jìn)行RFLP分析,對(duì)普通女性人群陰道分泌物中的支原體進(jìn)行詳細(xì)分類。研究支原體在普通女性下生殖道中的定植情況與分型。調(diào)查人群包括女性健康體檢人群、孕早中期婦女以及婦科門診患者,明確支原體在這一人群中的流行病學(xué)情況,為進(jìn)一步研究支原體與女性下生殖道疾病的關(guān)系提供理論依據(jù)。 研究方法和過程:收集健康體檢女性、孕早中期婦女、以及普通婦科門診患者陰道分泌物190例。研究對(duì)象選取標(biāo)準(zhǔn):研究對(duì)象均有性生活史,在兩周內(nèi)未使用過任何抗生素,取樣三天內(nèi)沒有陰道沖洗、無陰道用藥及性生活,排除經(jīng)期女性。 研究中收集到的陰道分泌物不經(jīng)傳統(tǒng)的培養(yǎng)法或是免疫法進(jìn)行初步篩選,而是直接用PCR法對(duì)分泌物進(jìn)行支原體檢測(cè)及分型,避免層層篩選造成的菌種丟失。這種應(yīng)用PCR方法對(duì)陰道分泌物直接進(jìn)行檢測(cè)的方法,目前在國(guó)內(nèi)相關(guān)臨床研究中沒有廣泛開展,本研究嘗試應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù),建立支原體的16SrDNA克隆文庫進(jìn)行RFLP分析,對(duì)普通女性人群陰道分泌物中的支原體進(jìn)行詳細(xì)分類。 檢索美國(guó)GeneBank核酸數(shù)據(jù)庫中已登錄各種支原體科微生物16SrDNA基因序列,設(shè)計(jì)了16SrDNA引物對(duì)GPO-和MGSO,其序列為:GPO-3:5'-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-3'MGSO:5'-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3'。支原體陽性樣本可以擴(kuò)增出約270bp的片段。電泳檢驗(yàn)270bp有條帶的樣品組的擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳回收,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用AluⅠ和RsaⅠ兩種限制性內(nèi)切酶消化,根據(jù)電泳產(chǎn)生的條帶,比對(duì)電子酶切的結(jié)果判斷支原體種類。為了驗(yàn)證結(jié)果的正確性,比對(duì)已經(jīng)鑒定的臨床株電泳結(jié)果,并根據(jù)酶切帶型的不同將轉(zhuǎn)化子分成不同的RFLP類型,每個(gè)RFLP類型中選取一定量的克隆子進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用Bioedit軟件將測(cè)序公司返回原序列進(jìn)行編輯,在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)分析。 研究對(duì)象的臨床資料、陰道分泌物涂片結(jié)果及支原體檢測(cè)結(jié)果錄入EXCEL數(shù)據(jù)庫,采用STATA8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn),精確概率法等進(jìn)行分析比較,運(yùn)用叉生分析進(jìn)行支原體與其他病原體致病關(guān)系的分析。 研究結(jié)果:本研究采用PCR—RFLP方法,在190例女性陰道分泌物中檢測(cè)Uu陽性39例(20.53%),Mh陽性52例(27.37%),Uu合并Mh陽性例26(13.68%),其他類型支原體未檢出。 研究對(duì)象的年齡在19—64歲之間,平均年齡為34.88歲,在不同年齡分組中,Uu、Mh的陽性率均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異:在女性健康人群(包括婦科體檢人群與孕早中期體檢婦女)與普通婦科門診患者中,Uu、Mh的陽性率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;Uu、Mh的陽性率在陰道炎、宮頸炎的發(fā)病人群中沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異:與人工流產(chǎn)次數(shù),與女性不同生理期如妊娠、絕經(jīng)等,均無相關(guān)性。 主要結(jié)論:1.本研究樣本中,女性下生殖道中的支原體檢出類型主要是Uu和Mh兩種。Uu和Mh陽性率在有性生活的女性中,與年齡、下生殖道炎癥、不良妊娠史、人工流產(chǎn)史、妊娠及絕經(jīng)與否沒有明顯的相關(guān)性。也就是說,本研究認(rèn)為:支原體中的Uu和Mh在女性下生殖道中可以正常存在,與女性年齡、不同生理期、以及下生殖道疾病沒有明顯相關(guān)性。 2.PCR方法應(yīng)用于支原體檢測(cè),特異性、敏感度高,可重復(fù)性強(qiáng),檢驗(yàn)周期短。本研究采用的PCR—RFLP方法,選用支原體通用引物GPO-3:5'-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-3'MGSO:5'-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3'及限制型內(nèi)切酶AluⅠ和RsaⅠ對(duì)支原體進(jìn)行檢測(cè)的同時(shí),可以確定支原體的不同分型,能夠方便、快捷、準(zhǔn)確地用于臨床支原體檢測(cè)。盡管本研究中沒有檢測(cè)到除Uu、Mh之外的其他類型支原體,但是對(duì)于難以培養(yǎng)的支原體的檢測(cè),本方法仍然可以借鑒使用。 3.由于本研究為初步的探索性研究,在選擇人群和病種方面可能存在一定的偏倚,因此該結(jié)果并不具有普遍的代表性,希望為大樣本的臨床聯(lián)合研究提供部分?jǐn)?shù)據(jù)。另外,對(duì)于Uu、Mh與女性上生殖道感染、不孕等疾病的關(guān)系,以及對(duì)妊娠結(jié)局和新生兒的影響,可以作為進(jìn)一步研究的目標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R759;R711.3
【圖文】：

碩士學(xué)位論文序。測(cè)序工作委托上海英俊生物技公司返回原序列進(jìn)行編輯，非嵌合分析SrDNA的擴(kuò)增用支原體16SrDN八通用性引物擴(kuò)大小與目標(biāo)基因相符，具有一定的特對(duì)照無擴(kuò)增。

隨機(jī)挑選克隆子，重新將克隆子內(nèi)質(zhì)粒中的插入片段擴(kuò)增出來。正確長(zhǎng)度的插入片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶Alul和天‘口I分別酶切及電泳分離，忽略產(chǎn)生的細(xì)小雜帶，記錄主要的酶切帶型(圖2一2，圖2一3)。Alul酶切電泳產(chǎn)生2種類型，兩種類型所占比例分別為:20.53%和27.37%;七口I也產(chǎn)生2種類型，對(duì)應(yīng)比例相同。這兩種酶對(duì)本庫的分辨能力相同，但是因?yàn)楸狙芯康臉颖局袃H檢測(cè)到Uu和Mh兩種支原體，Alul產(chǎn)生的兩種酶切圖譜條帶應(yīng)分別為80bp，147bp，42bp和86bp，190bp

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2731341