發(fā)布時(shí)間：2020-06-15 11:23

【摘要】： 皮膚惡性黑素瘤起源于黑素細(xì)胞,致死率高,轉(zhuǎn)移后無(wú)有效療法。miRNAs是一類(lèi)新發(fā)現(xiàn)的在腫瘤中發(fā)揮癌基因或抑癌基因樣作用的小分子RNA。本課題研究miRNA-let-7a在皮膚黑素瘤發(fā)病機(jī)制中的作用,尋找皮膚黑素瘤新的早期診斷標(biāo)記和治療靶點(diǎn)。 目的研究miRNA-let-7a在福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的皮膚黑素瘤組織和黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375中的表達(dá),探討1niRNA-let-7a對(duì)黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制；研究BRAF蛋白在黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和原代黑素細(xì)胞的表達(dá)差異,探索miRNA-let-7a對(duì)黑素瘤發(fā)病中關(guān)鍵蛋白BRAF的作用。 方法 選取福爾馬林固定石蠟包埋的黑素瘤組織13例,先天性色素痣組織10例,培養(yǎng)黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和原代黑素細(xì)胞,分別采用High Pure miRNA Isolation試劑盒和RNAiso Plus抽提miRNA及總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,用Taqman MGB探針和相應(yīng)的引物,在ABI Prism 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。對(duì)SDS軟件生成的數(shù)值進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)BRAF蛋白在黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375及原代黑素細(xì)胞的表達(dá)差異。 應(yīng)用cy3標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。利用hsa-let-7a的模擬物及其陰性對(duì)照分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375,CCK-8實(shí)驗(yàn)計(jì)算轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞增殖的差異,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞凋亡的不同,免疫印跡實(shí)驗(yàn)分析兩組細(xì)胞Caspase-3((半胱天冬酶-3)蛋白和BRAF蛋白的表達(dá)差異。 結(jié)果從福爾馬林固定石蠟包埋的組織中成功抽提出miRNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示miRNA-let-7a在FFPE黑素瘤組織中的表達(dá)明顯低于色素痣組織(P0.05),在黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375中的表達(dá)明顯低于原代黑素細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)siRNA的轉(zhuǎn)染效率約80-90%。與陰性對(duì)照相比,50nM的hsa-let-7a模擬物轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞后,1niRNA-let-7a的表達(dá)升高2.067倍。采用miRNA-let-7a的模擬物轉(zhuǎn)染后,與陰性對(duì)照相比,A375細(xì)胞增殖受抑,細(xì)胞凋亡增加(P0.05)。與黑素細(xì)胞相比,BRAF蛋白在黑素瘤A375細(xì)胞系表達(dá)升高；與陰性對(duì)照相比,miRNA let-7a的模擬物轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞系后,caspase-3蛋白和BRAF蛋白表達(dá)均下降。 結(jié)論FFPE組織適合用來(lái)研究miRNA在黑素瘤中的表達(dá),miRNA-let-7a在黑素瘤中表達(dá)下調(diào),過(guò)表達(dá)miRNA-let-7a可抑制黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡,促進(jìn)凋亡的機(jī)制可能與miRNA-let-7a下調(diào)caspase-3有關(guān)。黑素瘤發(fā)病中的關(guān)鍵蛋白BRAF在黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375中的表達(dá)明顯高于原代黑素細(xì)胞,miRNA-let-7a可下調(diào)BRAF蛋白的表達(dá)�？傊�,miRNA-let-7a可能在黑素瘤的發(fā)病中發(fā)揮抑癌基因的作用,有望成為黑素瘤早期診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R739.5
【圖文】：

圖1miRNA與癌癥關(guān)聯(lián)圖a正常組織中miRNA下調(diào)相應(yīng)的靶基因的表達(dá)發(fā)揮生物學(xué)作用bm1RNA的靶基因是原癌基因，發(fā)揮腫瘤抑制基因樣作用cmiRNA的靶基因是抑癌基因，發(fā)揮癌基因樣作用。巨前己發(fā)現(xiàn)數(shù)種miRNA在黑素瘤細(xì)胞表達(dá)異常，其中miRNA一221和miRNA一222在黑素瘤中表達(dá)升高，可以通過(guò)下調(diào)p27KIPI/CDKNIB和c一心T受體兩條通路來(lái)促進(jìn)黑素細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，在黑素瘤中發(fā)揮癌基因樣作用卜61。而miRNA一137、一34a、一199a和let一7家族成員let一7a、let一7b等，分別下調(diào)相應(yīng)的靶基因，在黑素瘤中發(fā)揮抑癌基因樣的作用卜12]。國(guó)內(nèi)僅王眾等研究了miRNA一21在黑素瘤細(xì)胞系的表達(dá)及其對(duì)黑素瘤細(xì)胞系活性的影響l’31。miRNA對(duì)黑素瘤相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控研究，不僅指向早期黑素瘤發(fā)生的新的調(diào)節(jié)機(jī)制，而且為將來(lái)靶向治療開(kāi)辟了道路。鑒于miRNA的特性，通過(guò)調(diào)節(jié)其表達(dá)控制腫瘤的生物學(xué)行為是目前治療腫瘤

由于miRNA分子量很小，本實(shí)驗(yàn)的試劑盒中含有一個(gè)帶莖環(huán)的引物，這樣逆轉(zhuǎn)錄后cDNA的鏈變長(zhǎng)，以利后續(xù)的定量PCR實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)圖2)。m唇RNA RTPrimer SSStePI:::SSStem·IooPRTTT右DNA TaqManPro加圖2采用 TaqManMGB探針?lè)ǖ亩鳵NA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)包括兩部，莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 陳宏翔;李碧芳;吳艷;劉厚君;李家文;涂亞庭;;皮膚惡性黑素瘤預(yù)后因素的多元回歸分析[J];華中醫(yī)學(xué)雜志;2008年01期

2 ;Brain metastases of malignant melanoma in Chinese:report of 23 cases[J];Chinese Medical Journal;2007年12期

本文編號(hào)：2714345