【摘要】： 沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,C.t)所致的泌尿生殖道感染近幾年迅速增多,無癥狀和慢性C.t感染所致的前列腺炎、不孕不育、異位妊娠、慢性盆腔炎等嚴(yán)重危害著患者的身心健康。目前,C.t泌尿生殖道感染的遷延難治、易于復(fù)發(fā)和耗資巨大已成為共識(shí),對(duì)C.t感染的研究已成為當(dāng)今國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一,C.t的預(yù)防和控制方法亟待改進(jìn)。沙眼衣原體疫苗的研究便是預(yù)防措施中的重點(diǎn)之一。已有的研究表明沙眼衣原體主要外膜蛋白(major outer membraneprotein,MOMP)表位決定了保護(hù)性抗體的產(chǎn)生,并且特異性的作為抗體的靶抗原。其相對(duì)分子質(zhì)量為40×10~3,是衣原體外膜復(fù)合物的主要成分,占外膜總蛋白的60%以上,因此人們研究最多的蛋白疫苗是MOMP。 目的:構(gòu)建ompl-pGEX6p-1重組質(zhì)粒,誘導(dǎo)表達(dá)C.t E型MOMP并行初步鑒定。 方法:提取C.t E型MOMP染色體DNA作為模板,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出完整的omp1基因,與載體pGEX6p-1經(jīng)雙酶切后連接重組,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL-21;重組子經(jīng)抗生素平板篩選后,挑取生長的單菌落培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期并提取重組質(zhì)粒,限制性核酸內(nèi)切酶BamHI,NotI雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定。IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),細(xì)菌裂解物離心的上清和沉淀分別行SDS-PAGE電泳。以抗谷胱甘肽抗體(anti-GST-tag antibody)作為一抗行Western—blotting技術(shù)初步鑒定。 結(jié)果:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1200bp位置出現(xiàn)明顯條帶,并經(jīng)測序鑒定與Genebank上提供的E型C.t omp1基因全序列同源性達(dá)99.92%,氨基酸序列同源性達(dá)100%,證明C.t E型omp1基因擴(kuò)增成功。omp1-pGEX6p-1重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定,分別在5000bp及1200bp位置出現(xiàn)條帶,初步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。誘導(dǎo)后得到53KD蛋白,并可被GST特異性抗體檢測,重組質(zhì)粒測序證明736位堿基發(fā)生突變出現(xiàn)終止密碼子,表達(dá)提前終止。 結(jié)論:(1)擴(kuò)增到完整的C.t E型omp1基因,并成功構(gòu)建了omp1-pGEX6p-1重組質(zhì)粒;(2)重組質(zhì)粒誘導(dǎo)后可表達(dá)53KD的蛋白,該蛋白可被GST特異性抗體結(jié)合;(3)重組質(zhì)粒與標(biāo)準(zhǔn)omp1基因序列比對(duì)結(jié)果理論上證明,目的蛋白具有一定的免疫原性。
【圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié)果Ex6p一l重組質(zhì)粒的構(gòu)建ompl基因的pCR擴(kuò)增性酶切位點(diǎn)的Pl、P2引物和高保真幾qDNA聚合酶PcR因，取5林1pCR產(chǎn)物經(jīng)l%瓊脂糖凝膠電泳，在約1200bp帶，，結(jié)果見圖1:

圖1c.tE型完整omPI基因的擴(kuò)增M;DNAMarker;1ompl擴(kuò)增產(chǎn)物;2陰性對(duì)照。粒的提取提取pGEX6P一1質(zhì)粒后取5閃直接電泳，用1%瓊in，可以見到質(zhì)粒被成功提取出來，電泳呈三條清晰
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R759

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本文編號(hào)：2709471