【摘要】： 目前已知的各種維A酸(RA)衍生物達(dá)2500余種之多,廣泛用于150種疾病的治療,特別是在治療難治性角化性皮膚病方面,例如銀屑病,為臨床醫(yī)師提供新的治療手段,而且其治療作用和適應(yīng)癥仍在不斷認(rèn)識和擴(kuò)展之中。RA療法被認(rèn)為是皮膚科藥物治療史上的“第二次革命”。 RA的基本結(jié)構(gòu)包括環(huán)己烯、側(cè)鏈和極性基團(tuán)三個部分組成,并據(jù)此分為三代,即非芳香類、單芳香類和多芳香類。第一代RA為天然存在的,包括全反式維A酸(atRA)、9-順式維A酸和異維A酸。第二代RA由人工合成,如依曲替酯及依曲替酸。第三代RA的顯著特點(diǎn)是引入了多芳香環(huán)狀結(jié)構(gòu),具有受體選擇性,提高了藥物作用的針對性,同時減少了不良反應(yīng),如阿達(dá)帕林、他扎羅汀。芳維A酸氨丁三醇具有多芳香環(huán)狀結(jié)構(gòu),屬于第三代維A酸。銀屑病特征性的病理變化是表皮細(xì)胞過度增殖和分化異常,同時伴隨顯著的炎癥反應(yīng)。 隨著銀屑病發(fā)病機(jī)制研究的深入,現(xiàn)多認(rèn)為銀屑病是在多基因遺傳背景下的免疫異常性疾病,異�；罨腡淋巴細(xì)胞及其分泌的多種細(xì)胞因子是發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。 RA在銀屑病治療過程中取得良好療效,但是其具體作用機(jī)制尚不清楚。研究表明其具有抗角質(zhì)形成細(xì)胞增生及抗腫瘤作用。近年來關(guān)于其免疫調(diào)節(jié)作用的研究越來越受到關(guān)注,認(rèn)為RA藥物可以從許多方面影響機(jī)體免疫系統(tǒng)功能,如免疫細(xì)胞的增殖分化、免疫活性信號的傳導(dǎo)、細(xì)胞因子的產(chǎn)生,從而影響細(xì)胞免疫功能和免疫球蛋白的產(chǎn)生,某些方面還對表現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)作用,然而,支持“RA具有調(diào)節(jié)免疫的作用”的研究資料的數(shù)量非常有限,而關(guān)于RA對正常機(jī)體免疫系統(tǒng)以及銀屑病時的機(jī)體免疫系統(tǒng)影響尚缺乏系統(tǒng)研究,相信,隨著研究的深入,這方面的研究將成為一個新的熱點(diǎn)。 關(guān)于第一代RA全反式維A酸(atRA)與9-順式維A酸,它們可以影響正常人外周血T淋巴細(xì)胞增殖,研究結(jié)果證實(shí):RA作用于健康人外周血T淋巴細(xì)胞是一個復(fù)雜的過程,作用機(jī)制是多樣性的。 JAK(Janus激酶)/STAT(信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子)信號途徑是與細(xì)胞生長、增殖和分化關(guān)系十分密切的一條信號通路,是細(xì)胞因子信號傳遞的主導(dǎo)作用,也是淋巴細(xì)胞活化的重要途徑之一。細(xì)胞因子在免疫細(xì)胞的生長、分化以及免疫調(diào)節(jié)中具有十分重要的作用,故JAK/STAT途徑與免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系已逐漸成為人們研究的一個新熱點(diǎn),對具體的信號轉(zhuǎn)遞過程及調(diào)控環(huán)節(jié)的詳盡研究,將有助于我們深入理解細(xì)胞間相互作用以及人體中正常的生理過程和某些疾病的發(fā)生機(jī)制,并可能為藥物的藥理學(xué)作用提供理論基礎(chǔ)。 Choi等用RA處理的大鼠腦部的星形膠質(zhì)細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)全反式和9-順式維甲酸,通過抑制JAK/STAT途徑的活化,進(jìn)而抑制INF-γ誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。JAK是蛋白酪氨酸激酶(PTK),迄今為止發(fā)現(xiàn)4種家族成員:JAK1,JAK2,JAK3,和TYK2。其中JAK3在活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞中有廣泛的表達(dá)。JAK3可以被IL-2、IL-4、IL-7激活,在某些情況下,JAK也可以被表皮生長因子受體(EGFR)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)等生長因子受體所活化。GU等人發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)病型銀屑病的病人的外周血混合淋巴細(xì)胞中JAK3高表達(dá)。 最近發(fā)現(xiàn)JAK/STAT途徑的激活,特別是STAT的激活,對于細(xì)胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)化產(chǎn)生重要影響。研究表明,正常情況下,STAT5對維持細(xì)胞的正常功能、調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化具有重要作用。當(dāng)STAT5不適當(dāng)活化時,通過引起下游靶基因如cyclinD1、c-myc和bcl-xL過度表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞癌變并阻斷細(xì)胞凋亡。STAT5的過度表達(dá)可能在各種癌癥發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用,STAT5在介導(dǎo)免疫耐受過程起重要作用,STAT5缺陷鼠表現(xiàn)為輕度的淋巴細(xì)胞減少和外周血T細(xì)胞增殖的缺陷。 受體選擇性RA的出現(xiàn)大大減少了RA衍生物在使用時的副作用,從而鼓勵了人們在RA類藥物構(gòu)型及結(jié)構(gòu)上的研究。芳維A酸氨丁三醇是在RAR選擇性激動劑芳香維A酸的基礎(chǔ)上加上氨丁三醇基團(tuán)合成的第三代RA,它增加了芳香維A酸的分子量和可溶度。本課題主要比較研究了芳維A酸氨丁三醇和第二代RA依曲替酸對銀屑病患者外周血T淋巴細(xì)胞增殖的劑量效應(yīng)及其與JAK3、STAT5轉(zhuǎn)錄及蛋白水平的相關(guān)性,研究藥物是否作用銀屑病患者外周血JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有助于從一個新的角度探索藥理機(jī)制,從而為治療銀屑病提供新的作用靶點(diǎn)。 第一部分芳維A酸氨丁三醇及依曲替酸對銀屑病患者外周血T淋巴細(xì)胞增殖的劑量效應(yīng) 目的:研究第三代RA(芳維A酸氨丁三醇)和第二代RA(依曲替酸)對銀屑病患者T淋巴細(xì)胞增殖的劑量效應(yīng)。 方法:抽取銀屑病人外周血,分離T淋巴細(xì)胞,經(jīng)不同濃度藥物處理后,臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力,用改良MTT法檢測淋巴細(xì)胞增殖變化。 結(jié)果:0.1μM的兩種藥物處理后,活細(xì)胞比例低(未選用該濃度),10-9-10-6mol/L濃度范圍內(nèi),兩種藥物均對銀屑病人外周血T淋巴細(xì)胞的增殖有抑制作用,與空白對照組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且兩種藥物之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論:芳維A酸氨丁三醇和依曲替酸可明顯抑制銀屑病患者外周血T淋巴細(xì)胞的增殖,且呈劑量依賴性,芳維A酸氨丁三醇比依曲替酸抑制作用更明顯。 第二部分芳維A酸氨丁三醇及依曲替酸對JAK3基因表達(dá)的影響 目的:研究芳維A酸氨丁三醇及依曲替酸對銀屑病患者T淋巴細(xì)胞表達(dá)的JAK3轉(zhuǎn)錄水平的變化。 方法:細(xì)胞按照5×105接種于培養(yǎng)瓶中,分別加入10-9～10-5 mol/L芳維A酸氨丁三醇、依曲替酸,對照孔不加藥, 37℃培養(yǎng)48h后,提取總RNA,以GAPDH/β-actin為內(nèi)參照,用Real-time PCR方法檢測JAK3mRNA表達(dá)變化。 結(jié)果:不同濃度的芳維A酸氨丁三醇和依曲替酸處理48h后,JAK3在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)相比其基礎(chǔ)表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論:兩種藥物均可下調(diào)銀屑病患者T淋巴細(xì)胞JAK3mRNA的表達(dá),且芳維A酸氨丁三醇的下調(diào)作用更顯著。 第三部分芳維A酸氨丁三醇及依曲替酸對JAK3、STAT5蛋白表達(dá)的影響 目的:研究芳維A酸氨丁三醇和依曲替酸對JAK3及其下游蛋白STAT5蛋白表達(dá)的影響。 方法:將上述經(jīng)藥物處理后的細(xì)胞,配成5×106個/mL細(xì)胞懸液。經(jīng)RIPA裂解液裂解蛋白, Western印跡法檢測JAK3、STAT5蛋白的表達(dá)。 結(jié)果:芳維A酸氨丁三醇和依曲替酸處理細(xì)胞48小時后提取JAK3蛋白表達(dá)相比基礎(chǔ)水平有顯著下調(diào);其下游蛋白STAT5表達(dá)相比其基礎(chǔ)表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差別 結(jié)論:芳維A酸氨丁三醇及依曲替酸明顯下調(diào)JAK3蛋白表達(dá),其下游STAT5蛋白表達(dá)無明顯改變。
【圖文】：

型微波爐 (日本三洋電機(jī)株式會社)（Axygen）PCR tube（Roche 公司）（Corning Incorporated, COSTAR）0 型紫外分光光度儀 （Pharmacia , Biotech , Cambridge ,Perkin-Elmer）ultiImager 多功能圖像分析儀（Bio-RAD）le Ⅱ反應(yīng)儀（Roche Molecular Biochemicals）PCR 原理CR 的檢測原理 的檢測原理PCR技術(shù)中，有一個很重要的概念—— Ct值。C代表Cycle，t：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（

1 None 95℃ 2min 1 None40℃ 30s 40 定量 95℃ 15s 40 定量 52℃ 15s 40定量72℃ 20s 起始濃度，各自與內(nèi)參比較，計(jì)算出不同全部數(shù)據(jù)均采用 SARS 醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié) 果丁三醇處理銀屑病患者外周血 T 淋巴細(xì)胞Ladder、購自 TaKaRa 公司）作為分子量如圖 2-1。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R758.63

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2705540