本文關鍵詞：RNA干擾技術對犬小孢子菌PQ-LRP基因沉默的研究及面部線狀紅斑狼瘡1例，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 在本課題組前期采用cDNA快速末端擴增法（RACE）得到膜蛋白PQ-LRP基因全長序列后，本實驗擬構建犬小孢子菌PQ-LRP基因RNA干擾載體，探究RNA干擾載體對犬小孢子菌PQ-LRP基因表達的影響，構建PQ-LRP基因RNA干擾株，為后期探討此基因在發(fā)病機制中的作用提供理論基礎及新型藥物的開發(fā)提供設計靶位。 方法： 1、提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為PCR模板，，用引物LRP-F和LRP-R擴增LRP基因的干擾序列，來得到長度為600bp的正向干擾片段，連接到PUC-PUT載體的Ptrpc啟動子和間隔序列之間，擬得到中間載體PUC-PLUT；再次用引物LRP-F和LRP-R擴增LRP基因的干擾序列，來得到長度600bp的反向干擾序列連接到PUC-PLUT載體的間隔序列和Ttrpc終止子之間，擬得到中間載體PUC-PLULT，與PCB309進行連接，最終構建出干擾載體PCB309-PLULT。 2、根據(jù)潮霉素不同濃度對照法，確定篩選犬小孢子菌轉(zhuǎn)化子的潮霉素最佳濃度。 3、采用電擊法將含有干擾載體PCB309-PLULT的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中，利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系對犬小孢子PQ-LRP基因進行沉默。 4、應用Real Time PCR方法檢測PCB309-PLULT載體對犬小孢子菌PQ-LRP基因表達的干擾作用。 結果： 構建了中間載體PUC-PLUT、PUC-PLULT，并通過PCR、基因測序進行鑒定；成功構建了長為8825bp的干擾載體PCB309-PLULT，并通過酶切測定為該目的載體；篩選出犬小孢子菌轉(zhuǎn)化子的潮霉素最佳濃度為300μg/ml；用實時定量PCR方法對犬小孢子菌干擾前后進行鑒定：以干擾前PQ-LRP相對表達量1.0為標準，干擾后PQ-LRP相對表達量為0.39，干擾后下調(diào)61%。 結論： 成功構建的干擾載體PCB309-PLULT可以明顯抑制犬小孢子菌PQ-LRP基因的表達，并成功構建了PQ-LRP基因干擾株，為研究膜蛋白PQ-LRP基因在犬小孢子菌致病中的功能奠定基礎。
【關鍵詞】：RNA干擾 犬小孢子菌 PQ-LRP基因
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R758.62
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 第一部分 RNA 干擾技術對犬小孢子菌 PQ-LRP 基因沉默的研究11-30
• 前言11
• 材料與方法11-20
• 1.實驗材料11-13
• 2.實驗方法13-20
• 2.1 質(zhì)粒提取、DNA 純化回收13
• 2.2 總 RNA 提取13-14
• 2.3 RNA 反轉(zhuǎn)錄14-15
• 2.4 感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化15
• 2.5 RNA 干擾載體 pCB309-PLULT 的構建15-17
• 2.6 電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化17-18
• 2.7 確定潮霉素的篩選濃度、制備轉(zhuǎn)化子并進行基因定量分析18-20
• 結果20-24
• 1. 犬小孢子菌的鑒定20
• 2. RNA 提取20
• 3. RNA 干擾載體 pCB309-PLULT 的構建20-21
• 4．PCB309-PLULT 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化21
• 5. PUC-PLUT 的測序21-23
• 6．確定犬小孢子菌對潮霉素的最佳轉(zhuǎn)化濃度23
• 7.應用 Real Time PCR 方法分析相對表達量23-24
• 討論24-27
• 結論27-28
• 參考文獻28-30
• 第二部分 面部線狀皮膚型紅斑狼瘡 1 例30-32
• 材料30-31
• 討論31
• 參考文獻31-32
• 綜述32-39
• 參考文獻37-39
• 攻讀學位期間發(fā)表論文情況39-40
• 致謝40-41

【參考文獻】

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本文編號：270215