【摘要】： 背景及目的:毛乳頭所固有的誘導(dǎo)毛囊形成的特性得到了廣泛認(rèn)同。即使將體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞移植入正常皮膚,仍然具有誘導(dǎo)毛發(fā)生長(zhǎng)作用。每個(gè)毛囊都有自己固有的生長(zhǎng)節(jié)律,其生長(zhǎng)周期并非同步進(jìn)行,所以單個(gè)毛囊的周期性生長(zhǎng)受到多種毛囊自身細(xì)胞的信號(hào)調(diào)控。目前對(duì)于毛囊生長(zhǎng)周期中各種基因的表達(dá)變化所知甚少。毛囊的分子生物學(xué)研究還需要深入探討。至今無(wú)毛囊體外重建成功的報(bào)道,其原因在于,這些研究?jī)H僅模擬了毛囊上皮和間質(zhì)的接觸作用環(huán)境,而無(wú)法真正提供含有細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)等重要成分的體內(nèi)環(huán)境,無(wú)法從根本上提供毛囊形成的基本條件。顯然細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)在毛囊發(fā)育中的發(fā)揮著重要作用。而Versican基因的表達(dá)與毛乳頭細(xì)胞的凝集性生長(zhǎng)顯正相關(guān),同時(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路控制著Versican的表達(dá)。因此,我們推測(cè)Versican基因有可能是控制毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因。本研究在我科建立的高效簡(jiǎn)便分離毛乳頭細(xì)胞的方法基礎(chǔ)上,應(yīng)用二步酶消化法分離毛乳頭細(xì)胞、并進(jìn)行體外培養(yǎng),觀察其體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性;應(yīng)用western blot檢測(cè)β-catenin和Versican的蛋白表達(dá)水平、激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)其標(biāo)記強(qiáng)度、RT-PCR法檢測(cè)β-catenin和Versican的基因表達(dá),并用siRNA干擾Versican的表達(dá)等方法研究Versican基因在毛乳頭凝集性生長(zhǎng)方式中的重要作用,為進(jìn)一步研究毛囊的生物學(xué)特征及毛囊形成過(guò)程中的影響因素奠定基礎(chǔ),為以Versican為靶點(diǎn)研究毛囊生物學(xué)特征提供良好的實(shí)驗(yàn)證據(jù)和理論支持。 方法:利用二步酶消化法分別培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞、真皮鞘細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞,觀察不同代次毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)的特征變化,應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞不同代次毛乳頭細(xì)胞中β-catenin和Versican的表達(dá)變化;采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建重組腺病毒顆粒pAdEasy-1/Wnt-3a并擴(kuò)增。并觀察低代(1-6)、高代(7-10代)毛乳頭細(xì)胞,Wnt-3a轉(zhuǎn)染、K-SFM、K-SFM+Wnt-3a誘導(dǎo)的高代凝集性生長(zhǎng)毛乳頭細(xì)胞;以及角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和毛囊真皮鞘細(xì)胞中β-catenin和Versican的表達(dá)變化差異;通過(guò)重組腺病毒顆粒pAdEasy-1/Wnt-3a轉(zhuǎn)染毛乳頭細(xì)胞,觀察外源性過(guò)表達(dá)Wnt-3a對(duì)毛乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)方式的影響;RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中Wnt-3a,β-catenin和Versican不同亞型的mRNA表達(dá)情況;激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)應(yīng)用β-catenin、Versican抗體標(biāo)記的各組細(xì)胞表達(dá)變化;并且以Wnt-3a腺病毒感染高代毛乳頭細(xì)胞,對(duì)比觀察感染腺病毒后高代毛乳頭細(xì)胞β-catenin及Versican基因表達(dá)變化。觀察高代毛乳頭細(xì)胞感染W(wǎng)nt-3a表達(dá)腺病毒后的生長(zhǎng)特性變化。用siRNA合成片段轉(zhuǎn)染低代毛乳頭細(xì)胞,觀察siRNA干擾Versican基因的表達(dá)對(duì)低代毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)的影響。 結(jié)果:體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞有凝集性生長(zhǎng)的特性,其凝集性生長(zhǎng)特性隨培養(yǎng)代次的增加逐漸減弱。western blot方法檢測(cè)不同代次毛乳頭細(xì)胞β-catenin及Versican蛋白水平變化,發(fā)現(xiàn)隨著毛乳頭細(xì)胞傳代次數(shù)的增加,β-catenin及Versican蛋白表達(dá)水平逐漸降低,且Versican蛋白降低幅度更大;低代毛乳頭細(xì)胞兩種基因表達(dá)與對(duì)照組成纖維細(xì)胞、毛囊真皮鞘細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞相比均有明顯差異,與高代毛乳頭細(xì)胞比較則有顯著差異;觀察不同代次毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)狀態(tài)的變化,發(fā)現(xiàn)隨著代次逐漸增高,毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)趨勢(shì)逐漸減弱,其減弱趨勢(shì)與Versican基因變化時(shí)間及幅度大致相同。采用成功構(gòu)建Wnt-3a表達(dá)腺病毒顆粒感染高代毛乳頭細(xì)胞后β-catenin及Versican基因mRNA和蛋白水平均明顯上調(diào),Versican基因上調(diào)更顯著達(dá)到了與低代毛乳頭細(xì)胞基本相同的水平;Wnt-3a腺病毒感染高代毛乳頭細(xì)胞后其出現(xiàn)凝集性生長(zhǎng)方式,與低代毛乳頭細(xì)胞的凝集性生長(zhǎng)相似。siRNA能有效干擾Versican基因在低代毛乳頭細(xì)胞中的表達(dá),其抑制效應(yīng)呈時(shí)間和強(qiáng)度依賴(lài)性,且在mRNA和蛋白水平均有顯著抑制,對(duì)β-catenin基因表達(dá)沒(méi)有顯著影響;Versican siRNA能顯著改變低代毛乳頭細(xì)胞的生長(zhǎng)方式,使其原本的凝集性生長(zhǎng)方式消失,與高代毛乳頭細(xì)胞的生長(zhǎng)方式相似。 結(jié)論: 一、Versican蛋白水平表達(dá)與毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)密切相關(guān);通過(guò)不同代次毛乳頭細(xì)胞中Versican和β-catenin表達(dá)研究,首次證明了Versican和毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)的關(guān)系。隨著毛乳頭細(xì)胞代次增加,其凝集性生長(zhǎng)的趨勢(shì)減弱,毛乳頭細(xì)胞β-catenin和Versican的表達(dá)逐漸降低,其中β-catenin的降低不如Versican明顯,而Versican的降低趨勢(shì)和凝集性生長(zhǎng)特性改變相關(guān)性緊密。 二、Wnt信號(hào)通道調(diào)節(jié)參與毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)特性的調(diào)控。Wnt-3a的過(guò)度表達(dá)有明確的誘導(dǎo)毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)的作用,作用機(jī)制可能是通過(guò)相關(guān)基因β-catenin、Versican的表達(dá)改變來(lái)實(shí)現(xiàn),并且其調(diào)節(jié)水平需達(dá)到一定的閾值方可發(fā)揮作用。而K-SFM也有部分誘導(dǎo)毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)的作用,作用機(jī)制與其中含有部分細(xì)胞因子有關(guān)。 三、Wnt-3a對(duì)毛乳頭細(xì)胞表達(dá)β-catenin和Versican有明確調(diào)節(jié)作用。過(guò)度表達(dá)Wnt-3a具有誘導(dǎo)人毛乳頭細(xì)胞β-catenin和Versican水平上調(diào)的能力;且誘導(dǎo)人毛乳頭細(xì)胞β-catenin水平上調(diào)的能力大于誘導(dǎo)Versican水平上調(diào)的能力,同時(shí)β-catenin和Versican的基因水平和蛋白水平的改變不對(duì)稱(chēng),因此可以初步明確Wnt-3a對(duì)Versican蛋白水平的調(diào)控過(guò)程可能以轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)節(jié)為主,但受到多種因素的影響。 四、應(yīng)用RNA干擾技術(shù)特異性的干擾毛乳頭細(xì)胞Versican基因表達(dá)時(shí),低代毛乳頭細(xì)胞Versican蛋白的表達(dá)降低,并且具有時(shí)間和濃度依賴(lài)性。Versican的V0/V1亞型對(duì)毛乳頭細(xì)胞的凝集性生長(zhǎng)特性影響較明顯,而V2和V3亞型可能不參與該特性的調(diào)控。干擾低代毛乳頭細(xì)胞Versican的表達(dá)時(shí)其凝集性生長(zhǎng)特性逐漸消失,進(jìn)一步說(shuō)明Versican基因在毛乳頭細(xì)胞的凝集性生長(zhǎng)中具有重要作用。
【圖文】：

④ 選擇顏色，取 HSI 顏色系統(tǒng)，S 與 I 都選 0 到 255，H 選 0 到 30 左右；⑤ 對(duì)所有的圖片進(jìn)行處理，調(diào)整灰度之間的色差，盡量使目標(biāo)區(qū)域的顏色盡別于背景色；測(cè)量目標(biāo)區(qū)域的光密度值，并統(tǒng)計(jì)目標(biāo)區(qū)域與整張圖片的比值。結(jié) 果(一) 細(xì)胞培養(yǎng)的觀察1. KC：消化法培養(yǎng)的 KC，每 2×2cm 大小的頭皮可獲得約 2×107個(gè)細(xì)胞，，細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞活性可達(dá) 90%以上，接種至瓶底鋪滿鼠尾膠原的培養(yǎng)瓶中(14 小時(shí)后即可在顯微鏡下觀察到細(xì)胞貼壁，伸出觸角，部分細(xì)胞之間出現(xiàn)天可見(jiàn)細(xì)胞集落間出現(xiàn)細(xì)胞連接，類(lèi)似地圖樣，一周左右細(xì)胞可達(dá) 70%融合滿瓶底，在瓶底呈鋪路石樣。圖 1-1：

傳代后細(xì)胞成長(zhǎng)加速，按 1：3 傳代，在顯微鏡下觀察，2～3 小時(shí)細(xì)胞貼壁角，細(xì)胞之間開(kāi)始有連接，4 天即可達(dá)到 70%～80%融合。2、DSC：經(jīng)酶消化法分離的 DSC，接種至培養(yǎng)瓶中或培養(yǎng)板中，細(xì)胞平均右開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，原代開(kāi)始生長(zhǎng)的 DSC 呈長(zhǎng)三角形，細(xì)胞生長(zhǎng)極其緩慢，細(xì)底 30%～40%后生長(zhǎng)有所加速，但是細(xì)胞鋪滿瓶底需要約 20 天左右，鋪滿瓶呈長(zhǎng)梭形，排列雜亂，但較 DPC 整齊。圖 1-2：
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R751

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本文編號(hào)：2685075