【摘要】： 皮膚是機體最大的器官。角質形成細胞是其主要組成成分,是保護體內器官免受外界環(huán)境有害物質刺激的重要生理屏障。大量研究顯示角質形成細胞在一些炎癥性皮膚病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。一旦受到外界因素和細胞因子的刺激,皮膚角質形成細胞能分泌多種炎癥因子,從而積極地參與機體炎癥和免疫反應。如角質形成細胞參與變應性接觸性皮炎發(fā)生、發(fā)展的全過程。在一些遺傳因素相關的皮膚病,如特應性皮炎,角質形成細胞成分可作為免疫佐劑參與疾病發(fā)生,并分泌過量的趨化因子和細胞因子,影響細胞生長與分化,也可以通過自分泌和旁分泌機制影響皮膚中其他細胞,促進疾病發(fā)生與發(fā)展。 TRPV1(transient receptor potential vanilloid receptor-1)是TRP家族成員,是一種鈣通道蛋白,人和大鼠的TRPV1已經被克隆。最初的研究發(fā)現(xiàn)TRPV1是表達于外周初級傳入神經元上重要的傷害感受器,參與了急性炎癥痛敏的形成。TRPV1可以被內源性、外源性香草醛類物質,熱刺激,酸,炎癥刺激和組織損傷等激活。TRPV1不僅存在于神經元細胞,還廣泛存在于非神經細胞上,例如呼吸道上皮細胞,心肌細胞,膀胱上皮細胞,胃壁上皮細胞和角質形成細胞。角質形成細胞中TRPV1受體的功能尤其是在皮膚神經網絡中的作用受到重視,因此也被看作是開發(fā)抗炎和鎮(zhèn)痛藥物的新的靶點。多種傷害性刺激通過直接誘導角質形成細胞,觸發(fā)了表皮的炎癥反應,升高了致炎因子和緩激肽等炎癥介質的水平。在人表皮角質形成細胞中TRPV1的活化能直接導致環(huán)氧酶-2的釋放。研究發(fā)現(xiàn),在人的鼻、氣管和肺上皮細胞中TRPV1在辣椒素(CAP)的作用下活化,能夠介導人上皮細胞中IL-6基因和蛋白表達水平的上調。說明TRPV1可能在角質形成細胞等非神經細胞分泌炎癥因子參與炎癥反應過程中發(fā)揮重要作用。針對TRPV1的藥物研究也將為皮膚炎癥性疾病的治療帶來新的前景。 為揭示角質形成細胞表達TRPV1的生物學功能,我們檢測了分離的人角質形成細胞和HaCaT細胞炎癥介質表達與TRPV1之間的關系。同時還研究了TRPV1活化后細胞內鈣離子的變化。利用瞬時轉染和雙熒光素酶檢測技術探討了TRPV1活化與NFκB活化的關系。在此基礎上,考察了臨床用于抗炎鎮(zhèn)痛的皂苷類活性成分對TRPV1表達及炎癥介質分泌的影響。 主要研究結果如下: 1. TRPV1mRNA在人角質形成細胞中有表達,且在CAP刺激下表達增加。經ELISA法檢測,CAP顯著升高了致炎因子IL-8和PGE2的表達水平,且呈劑量依賴性。8μmol/L CAP可以使角質形成細胞IL-8顯著升高62.75%,使PGE2升高54.73%。這種作用能夠被TRPV1受體拮抗劑CPZ抑制,說明TRPV1活化促進了致炎因子的表達。 2.經流式細胞儀檢測熒光探針的方法,發(fā)現(xiàn)2～16μmol/L CAP能劑量依賴性增加HaCaT細胞內鈣離子濃度。而3μmol/L CPZ、10μmol/L CPZ和20μmol/L CPZ分別使CAP刺激升高的熒光強度降低了32.11%、38.33%和34.66%。CPZ的抑制作用表明,TRPV1活化導致胞內鈣離子濃度的改變。 3.經流式細胞儀和western blot方法鑒定,成功構建了能夠穩(wěn)定表達TRPV1蛋白的HEK293T細胞株。利用該細胞株研究證實,TRPV1介導了CAP刺激HEK 293T-TRPV1細胞內鈣離子濃度升高,主要是細胞外鈣離子內流的結果。 4.利用瞬時轉染及雙熒光素酶檢測技術,將pNFκB和pRL-TK質粒共同轉染HEK293T細胞、HaCaT細胞和HEK 293T-TRPV1細胞,比較三種細胞經CAP刺激后NFκB的活化水平。結果表明CAP能夠顯著增強經瞬時轉染的HaCaT細胞和HEK 293T-TRPV1細胞中NFκB轉錄活性,而HEK293T細胞中無明顯變化。TRPV1受體拮抗劑能夠抑制CAP誘導NFκB活化的作用,說明TRPV1活化后進一步通過信號的傳遞誘導了NFκB的激活。 5.利用特異性PI3K和MAPK信號途徑抑制劑,分別阻斷該兩條信號傳導通路,發(fā)現(xiàn)PD98059、Wortmannin分別使HEK 293T-TRPV1細胞的NFκB轉錄活性降低了52.42%、24.52%,經統(tǒng)計分析,有顯著差異(P0.05)。說明TRPV1活化促進NFκB激活的作用與MAPK和PI3K信號傳遞途徑有關。 6.人參皂苷Rb1能夠顯著降低HaCaT細胞中CAP誘導的TRPV1 mRNA表達,抑制對NFκB的活化作用,使炎癥因子IL-8、IL-6和PGE2的分泌水平分別下降26.72%、38.23%和57.01%。在HEK293T-TRPV1細胞株中,Rb1能夠顯著降低CAP誘導細胞內鈣離子濃度,特異地抑制CAP誘導的NFκB活化。由此可見,Rb1能夠抑制TRPV1受體而發(fā)揮作用。 7.芍藥苷(PF)能夠顯著降低CAP升高的IL-8、IL-6、PGE2水平,下降了11.39%、51.96%。75.98%。比較PF對HaCaT細胞和HEK293T-TRPV1細胞株經CAP誘導升高的細胞內鈣離子的干預作用,表明PF可能存在其他的通道影響鈣離子內流,而不是直接與TRPV1相關的。 8. CAP對細胞分泌TNFα影響不顯著。三七皂苷R1和人參皂苷Rg1對CAP依賴的TRPV1受體活化、鈣離子內流及信號傳遞通路沒有明顯干預作用。 9.經二維電泳分析和MALDI-TOF-MS鑒定發(fā)現(xiàn),CAP刺激HaCaT細胞表達差異蛋白有磷酸甘油醛異構酶,烯醇化酶1和角蛋白14,其在TRPV1活化后致炎癥介質表達中的作用,有待于進一步研究。
【圖文】：

35pTRPV1eGFP 為 7266bp （圖 2.2 ）。圖2.2 ：質粒電泳圖M: marker; 1: pTRPV1; 2: pTRPV1-GFP; 3: pEGFP-N1Fig 2.2 . Electrophoresis results of pTRPV1 and pTRPV1eGFP constructs. Lane M and lane1-4represents marker, pTRPV1, pTRPV1eGFP and pEGFP-N1 plasmid expression vectorrespectively.1. 2 TRPV1 表達載體的鑒定測序結果在GenBank中采用BLAST程序進行序列同源性分析的結果表明，該序列與 NCBI Gene 中報道的 Trpv1 transient receptor potential cation channel,subfamily V, member 1 （Rattus norvegicus，GeneID: 83810）同源性為 100％。TAGGACCCGGTGACGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGCGACCGGTGGATCCCGGGCCCCTTTCTCCCCTGGGACCATGGAATCCTTGAAAACCTCAGCATCCTCTGGCTTAAGGGATCCCGTATAATGCTTCAGTTGAACTTCTTCCTGCTGGGTGGCATGTCTATCTCGAGTGCTTGCATCCCTCAGAAGGGGAACCAGGGCAAAGTTCTTCCAGTTTCTCCCTGAAACTCGGCCTGACCTCAGGGAGAAGCTCAGGGTGCGCTTGACGCCCTCACAGTTGCCTGGGTCCTCGTTGATGATACCCACATTGGTGTTCCAGGTAGTCCAGTTTACCTCGTCCACCCTGAAACACCACCGGTAGTCATCCTTGCCGTCAGGAGTGAACCCCACCTGCAGCAGCTTGCCAGAGCGGAAGGCCTTCCTCATGCACTTCAGGAAGCTCTTCTCTGTATCCAGGATGGTGATGGCTCTCTGCAGCTTCCAGATGTTCTTGCTCTCTTGTGCAATCTTGTTGACGGTCTCACCCATGAGAGCAATGAGCATGTTGAGCAGAAGGATGTAGGTGAGAATCACATAGGCCAGTAACAGGATGATGAAGM 1 2 32501,0002,5005,0007,50010,00015

染了含 GFP 熒光蛋白質粒的細胞，轉染效率約為 30%（圖 2.3 A,B）。細胞經G418 篩選 2 周后，，置熒光顯微鏡下觀察，可見轉染了綠熒光蛋白質粒的細胞數(shù)目顯著增多。經 4%多聚甲醛溶液固定的細胞片于激光共聚焦顯微鏡下觀察（圖 2.3 C，D）。可見，帶有綠熒光蛋白的質粒已經轉染至細胞，并在膜上表達。A．對照質粒 pEGFP-N1 轉染 293T 細胞（轉染后 24h）B．質粒 pTRPV1eGFP 轉染 293T 細胞（轉染后 24h）（×40）
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R751

【引證文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 王耀帥;艾灸以溫促通效應與TRPV1的相關性研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2012年

本文編號：2684284