【摘要】：背景和目的毛囊(HF)是哺乳動(dòng)物一個(gè)復(fù)雜的小器官,由上皮和間充質(zhì)成分相互作用而組成。毛乳頭細(xì)胞(dermal papilla cells,DPCs)被認(rèn)為是一種獨(dú)特的間充質(zhì)干細(xì)胞,具有自體干細(xì)胞治療的潛力,位于毛囊底端的毛球部,被真皮鞘和毛母質(zhì)細(xì)胞包繞。DPCs作為HF的信號(hào)中心,在調(diào)節(jié)毛發(fā)生長、形成和循環(huán)中發(fā)揮重要作用。外泌體(exosome or extracellular vesicles,EV)是由不同細(xì)胞類型分泌的納米囊泡,它們本身攜帶大量生物信息:如調(diào)節(jié)蛋白、mRNA和microRNA(miRNA)。干細(xì)胞來源的外泌體具有類似干細(xì)胞的功能,在多種病理模型中起積極的治療作用,且具有細(xì)胞療法所不具備的優(yōu)勢。因此,我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DP來源的外泌體(DP derived exosome,DP-Exo)在部分損傷毛囊中的作用并驗(yàn)證其對(duì)毛囊周期的影響,最后,通過對(duì)外泌體miRNA測序和生信分析,進(jìn)一步研究DP-Exo作用靶點(diǎn)基因及其相關(guān)通路,探討其作用機(jī)制。方法1.人DPCs來源的外泌體對(duì)人毛母質(zhì)細(xì)胞的作用利用顯微解剖法聯(lián)合酶消化法分別提取培養(yǎng)人的毛乳頭細(xì)胞,收集低代毛乳頭細(xì)胞(P1-P3)的條件培養(yǎng)基,通過高速離心法提取人DPCs來源的外泌體,將不同濃度的外泌體加入到人毛母質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中,用CCK8增殖試驗(yàn)檢測毛母質(zhì)細(xì)胞增殖情況,并進(jìn)行免疫熒光、劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期檢測,評(píng)估外泌體在體外對(duì)毛母質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)活性和特性的影響。2.小鼠DPCs來源的外泌體對(duì)小鼠HFSCs的作用利用顯微解剖法和酶消化法獲取小鼠的毛囊干細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)。將小鼠毛乳頭細(xì)胞外泌體以不同的濃度梯度加入到毛囊干細(xì)胞培養(yǎng)基中,觀測小鼠DPCs來源的外泌體對(duì)小鼠毛囊干細(xì)胞增殖、遷移活性的影響。3.小鼠毛乳頭細(xì)胞來源的外泌體對(duì)部分損傷后的毛囊再生的影響構(gòu)建部分損傷毛囊再生動(dòng)物模型:取C57小鼠觸須墊,分離單根生長期鼠須毛囊,將進(jìn)行下三分之一橫斷后的上三分之二橫斷毛囊移植入裸鼠背部中線左側(cè)皮下,完整毛囊作為對(duì)照移植入背部中線右側(cè)皮下。對(duì)模型分別用低代小鼠毛乳頭細(xì)胞,低代DP-Exo和PBS進(jìn)行干預(yù),30天后觀測橫斷毛囊再生情況并進(jìn)行HE染色。4.毛乳頭細(xì)胞來源的外泌體對(duì)毛囊生長周期的影響取7周齡C57雌性小鼠,進(jìn)行背部脫毛,每隔2天注射小鼠毛乳頭細(xì)胞來源的外泌體,局部涂抹米諾地爾作為陽性對(duì)照,PBS注射作為陰性對(duì)照,每隔7天觀測鼠背毛囊生長情況,并取材做組織學(xué)檢測,評(píng)估毛囊生長周期。5.毛乳頭來源的外泌體生發(fā)作用的機(jī)制探討提取小鼠毛乳頭細(xì)胞外泌體miRNA,并送檢做miRNA高通量測序,檢測外泌體miRNA成分并進(jìn)行定量,利用miRWalk 2.0和DAVID 6.8生信分析軟件進(jìn)行miRNA靶基因預(yù)測,利用GO和KEGG基因富集通路,并用STRING database數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因相關(guān)蛋白互作分析,并篩選出外泌體miRNA作用的關(guān)鍵通路靶基因。免疫熒光染色檢測外泌體干預(yù)后再生毛囊干細(xì)胞標(biāo)記物變化,細(xì)胞增殖情況,利用RT-PCR,Western-blot和免疫熒光檢測關(guān)鍵靶基因在治療中期和末期的表達(dá)情況的變化。結(jié)果1.外泌體促進(jìn)毛母質(zhì)細(xì)胞的增殖,遷移細(xì)胞周期測試以及Ki67免疫熒光結(jié)果提示:人來源的DP-Exos被毛母質(zhì)細(xì)胞攝取后,能顯著促進(jìn)毛母質(zhì)細(xì)胞的增殖,其中10μg/ml的外泌體具有最強(qiáng)的促毛母質(zhì)細(xì)胞增殖的作用。劃痕實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,DP-Exos能顯著促進(jìn)毛母質(zhì)細(xì)胞的遷移能力,其中10μg/ml濃度的外泌體作用效果最為顯著。2.DPCs來源的外泌體對(duì)毛囊干細(xì)胞的作用CCK-8和Ki67免疫熒光提示:10μg/ml小鼠來源外泌體能顯著促進(jìn)小鼠HFSCs的增殖。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:10μg/ml小鼠來源外泌體能顯著促進(jìn)小鼠HFSCs的遷移。3.小鼠DP-Exo對(duì)部分損傷的毛囊再生的影響上三分之二橫斷毛囊移植30天后有一定幾率獲得再生,再生率低且再生毛乳頭小,再生毛囊細(xì)小,上三分之二橫斷毛囊移植并用毛乳頭細(xì)胞和毛乳頭來源外泌體干預(yù)后毛囊再生率顯著提高,細(xì)胞治療組和外泌體治療組間無顯著性差異。用Dil標(biāo)記毛乳頭細(xì)胞和外泌體,治療后30天進(jìn)行熒光示蹤,結(jié)果為發(fā)現(xiàn):移植的毛乳頭細(xì)胞大部分整合于真皮鞘,少量進(jìn)入毛乳頭內(nèi)部,毛乳頭移植組和外泌體注射組毛乳頭里可以看到Dil點(diǎn)狀熒光信號(hào)。4.毛乳頭細(xì)胞來源的外泌體對(duì)毛囊生長周期的影響DP-Exo治療開始后14天內(nèi)顯示超過80%的毛干長出皮外,毛囊完全再生,到第21天幾乎完全毛發(fā)再生。米諾地爾治療組21天毛發(fā)再生率約為77%,而PBS組為35%。在14天時(shí),DP-Exo是米諾地爾組背部毛發(fā)覆蓋率的3.8倍,是對(duì)照組14倍。治療21天后DP-Exo治療組皮膚厚度高于米諾地爾組和PBS組。5.毛乳頭來源的外泌體生發(fā)作用的機(jī)制探討miRNA高通量測序定量分析得出Top30外泌體miRNA,GO富集到66個(gè)關(guān)鍵靶基因,KEGG富集到41條通路。PPI蛋白互作結(jié)果顯示:Wnt5a,BMP2和BMP4為關(guān)鍵的中樞基因。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,外泌體治療中期和晚期,再生毛囊中K15、CD34陽性細(xì)胞顯著增加,免疫熒光、Wb和RT-PCR等實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,關(guān)鍵通路基因Wnt5a,BMP2和BMP4表達(dá)量較對(duì)照組顯著下調(diào)。結(jié)論1.低代毛乳頭來源的外泌體能促進(jìn)毛母質(zhì)細(xì)胞的增殖遷移。2.代毛乳頭來源的外泌體能促進(jìn)毛囊干細(xì)胞增殖遷移。3.DP-Exo能促進(jìn)部分損傷的毛囊再生。4.DP-Exo能促進(jìn)毛囊由休止期向生長期轉(zhuǎn)換。5.DP-Exo通過其攜帶的miRNA影響毛囊信號(hào)通路,通過作用于Wnt5a,BMP2,BMP4等關(guān)鍵通路基因,下調(diào)相關(guān)毛囊抑制信號(hào)蛋白從而促進(jìn)毛囊再生和進(jìn)入生長期。
【圖文】：

細(xì)胞培養(yǎng)３天后顯微鏡下觀察可見：ＤＰＣｓ呈同心圓聚集性生長。同心圓中逡逑間是折光性差、體積下的未遷出毛乳頭，周圍圍繞遷出及增殖的毛乳頭細(xì)胞。逡逑ＤＰＣｓ呈半透明的長梭形，人ＤＰＣｓ比小鼠ＤＰＣｓ體積稍大（圖１－１）。ＤＰ在接種逡逑后３天后完全貼壁，且部分ＤＰ周圍可見少量細(xì)胞遷出，遷出的ＤＰＣｓ呈長梭形逡逑或多邊形，繼續(xù)培養(yǎng)會(huì)有更多細(xì)胞遷出并增殖（圖Ｍ），外觀類似于真皮成纖維逡逑細(xì)胞，排列方式為同心圓狀。ＤＰＣｓ特異性標(biāo)記物為ＡＬＰ、Ｖｅｒｓｉｃａｎ、ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ逡逑等，因此我們利用免疫熒光共染的方法將Ｐ３代小鼠ＤＰＣｓ共染ＡＬＰ與ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ，逡逑結(jié)果顯示ＡＬＰ（紅色）與ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ（綠色）共同定位于毛乳頭細(xì)胞（圖１－２）。逡逑－＾＾ｒｍＢＴＯｎ＇Ｗｒ邋ｆ？逡逑閣１－１．小鼠觸須（左）及人毛囊（右）ＤＰＣｓ的體外原代培養(yǎng)及觀察。比例尺＝５００叫！。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１．邋Ｔｈｅ邋ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｈｕｍａｎ（ｌｅｆｔ）邋Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ邋ｍｉｃｅ邋ｖｉｂｒｉｓｓａｅ邋（ｒｉｇｈｔ）邋ｄｅｒｍａｌ逡逑ｐａｐｉｌｌａ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ．邋；Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒｓ＝５００＾ｍ．逡逑１１逡逑

２．邋ＤＰＣｓ來源的外泌體提取、鑒定逡逑我們采用高速離心法分離得到外泌體，外泌體在電鏡下觀察室圓形或者杯逡逑狀結(jié)構(gòu)（圖２Ａ，Ｂ）。粒徑檢測發(fā)現(xiàn)外泌體直徑在５８．８－２５５．０邋ｎｍ之間，平均直逡逑徑為９１．３±１８＿（圖２0。外泌體表面標(biāo)記物從０（，０９，能被＿檢測到，而逡逑細(xì)胞成分標(biāo)記物ｃａｌｎｅｘｉｎ卻不能。此外，我們還能再外泌體中檢測到毛乳頭分泌逡逑的調(diào)節(jié)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶３邋（ｍａｔｒｉｘ邋ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ邋３，ＭＭＰ３）（圖２Ｅ）。逡逑為了證明外泌體能被毛母質(zhì)細(xì)胞攝取利用，我們將人毛母質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染ＧＦＰ綠色逡逑突光蛋白，ＤＰ－Ｅｘｏ用Ｄｉｌ標(biāo)記。將外泌體以不同量加入含４ｍｌ全培液的毛母質(zhì)逡逑細(xì)胞并孵育４８ｈ觀察，紅色熒光標(biāo)記的外泌體能在毛母質(zhì)細(xì)胞內(nèi)聚集，，細(xì)胞內(nèi)逡逑外泌體聚集表現(xiàn)為濃度依賴性，加入４0ｎｇ邋（濃度ｌ0ｎｇ／ｍｌ）的外泌體培養(yǎng)組中，逡逑細(xì)胞內(nèi)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R758.71

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