【摘要】： 流行病學(xué)研究表明低濃度砷劑的暴露與皮膚癌等各種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。砷劑雖然被公認(rèn)為是人類(lèi)的致癌劑之一,但是其致癌作用機(jī)制仍存在爭(zhēng)論。有的學(xué)者認(rèn)為砷劑可單獨(dú)引起腫瘤的發(fā)生,而有的學(xué)者認(rèn)為砷劑只是協(xié)同其它致癌物導(dǎo)致正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。p53基因是已知的抑癌基因之一,其介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑在細(xì)胞的增殖分化、應(yīng)激和癌變等生命過(guò)程中起著極其重要的作用,被稱為“基因組衛(wèi)士”。鼠雙微粒體2(murine double minute2,MDM2)基因是p53的下游基因之一,p53可激活MDM2轉(zhuǎn)錄,MDM2反過(guò)來(lái)又抑制p53的功能,二者形成自動(dòng)調(diào)節(jié)反饋環(huán),以保持正常情況下p53處于低水平狀態(tài)。正確的亞細(xì)胞定位對(duì)于p53的功能活性十分重要,p53被激活后進(jìn)入胞核內(nèi),激活其靶基因的轉(zhuǎn)錄,之后回到胞漿中被降解。MDM2由于具有核輸出序列(NES)和核定位序列(NLS)而具有核漿穿梭能力,NES使MDM2由胞核到胞漿而NLS使之由胞漿到胞核。MDM2蛋白可把p53/MDM2復(fù)合物直接運(yùn)出細(xì)胞核,MDM2的核漿穿梭能力對(duì)其抑制p53的功能活性非常重要。本課題研究中,我們以hTERT永生化的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞為研究對(duì)象,探討了砷劑對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞p53功能的影響及MDM2在其中所起的作用機(jī)制,為闡明砷劑引起皮膚癌的機(jī)理提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一章低濃度砷劑經(jīng)由上調(diào)MDM2介導(dǎo)p53胞漿分布所致功能失活 目的:探討低濃度砷劑對(duì)人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中MDM2蛋白的影響及其與p53的亞細(xì)胞分布狀態(tài)和功能的關(guān)系。 方法:以hTERT永生化的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞為研究對(duì)象。采用蛋白印跡法(Western blotting)研究0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L亞砷酸鈉處理12小時(shí)和24小時(shí)后MDM2、p53和絲氨酸15位磷酸化的p53蛋白的表達(dá)水平,并且與5-Fu和紫外線處理作比較。采用細(xì)胞免疫熒光染色法研究砷劑處理前后p53蛋白的亞細(xì)胞定位及細(xì)霉素B和Nutlin-3預(yù)處理對(duì)其影響。 結(jié)果:低濃度砷劑上調(diào)了角質(zhì)形成細(xì)胞中MDM2蛋白的表達(dá),但對(duì)p53蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。隨著低濃度砷劑劑量的逐漸增加,MDM2蛋白的表達(dá)水平亦逐漸增加;隨著砷劑作用時(shí)間的逐漸增加,MDM2蛋白的表達(dá)水平也逐漸增強(qiáng)。低濃度砷劑處理后角質(zhì)形成細(xì)胞p53蛋白主要分布在胞漿。細(xì)霉素B和Nutlin-3預(yù)處理可以阻斷砷劑誘導(dǎo)的p53胞漿分布。先用低濃度砷劑處理角質(zhì)形成細(xì)胞后再加5-Fu刺激,此時(shí)5-Fu激活p53功能受到明顯的抑制。 結(jié)論:低濃度砷劑呈劑量和時(shí)間依賴性上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞中MDM2蛋白的表達(dá);低濃度砷劑可經(jīng)由上調(diào)MDM2蛋白表達(dá)介導(dǎo)p53的胞漿分布;低濃度砷劑誘導(dǎo)的p53胞漿分布導(dǎo)致p53功能性失活。 第二章低濃度砷劑上調(diào)MDM2的機(jī)制探討 目的:探討低濃度砷劑上調(diào)MDM2表達(dá)的作用機(jī)制。 方法:構(gòu)建pGL3-MDM2基因啟動(dòng)子報(bào)告基因表達(dá)載體,采用熒光素酶報(bào)告基因分析方法觀察亞砷酸鈉對(duì)MDM2基因P1、P2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。應(yīng)用1μmol/L和2μmol/L亞砷酸鈉處理皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞24h后采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)MDM2 mRNA的表達(dá)水平。應(yīng)用PD98059、SB203580和LY294002等特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑預(yù)處理后再觀察砷劑對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞MDM2表達(dá)的影響。 結(jié)果:低濃度砷劑可顯著誘導(dǎo)MDM2基因P1啟動(dòng)子的熒光素酶活性(P＜0.05)。隨著低濃度砷劑的劑量逐漸增加,MDM2 mRNA的表達(dá)水平逐漸增高。PD98059預(yù)處理可完全阻斷砷劑上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞中MDM2的表達(dá),而SB203580和LY294002預(yù)處理對(duì)砷劑誘導(dǎo)的MDM2表達(dá)上調(diào)無(wú)明顯影響。 結(jié)論:通過(guò)MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,低濃度砷劑激活MDM2基因P1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,從而誘導(dǎo)MDM2的表達(dá)。 第三章低濃度砷劑通過(guò)功能性失活p53發(fā)揮輔助致癌作用 目的:探討低濃度砷劑對(duì)紫外線引起角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的影響及其與砷性皮膚癌作用機(jī)制的關(guān)系。 方法:應(yīng)用0.5μmol/L和1μmol/L亞砷酸鈉處理角質(zhì)形成細(xì)胞24h后,再用40mJ/cm~2紫外線照射。采用流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst33258胞核染色檢測(cè)砷劑和UV引起的細(xì)胞凋亡。 結(jié)果:0.5μmol/L和1μmol/L砷劑處理角質(zhì)形成細(xì)胞后凋亡率分別為1.2%和1.5%,與正常對(duì)照組1.5%無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。而先經(jīng)過(guò)0.5μmol/L和1μmol/L砷劑預(yù)處理后的角質(zhì)形成細(xì)胞再照射紫外線,此時(shí)凋亡率分別為48.8%和39.9%,與未經(jīng)砷劑預(yù)處理直接照射UV組凋亡率64.7%相比有顯著性差異(P＜0.05)。表明砷劑預(yù)處理可導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)UV的凋亡抗性。Hoechst33258核染色結(jié)果與之相一致。 結(jié)論:低濃度砷劑暴露可損害皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)紫外線引起的凋亡反應(yīng);低濃度砷劑可通過(guò)功能性失活p53從而發(fā)揮其輔助致癌作用。
【圖文】：

1.3.1低濃度砷劑上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞MDMZ蛋白的表達(dá)但對(duì)p53蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響如圖I一1所示，lunil幾亞砷酸鈉處理皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞后 westemblotting結(jié)果顯示MDMZ蛋白明顯上調(diào)，但p53蛋白的表達(dá)無(wú)明顯差異;且反映p53功能活化的絲氨酸巧位磷酸化的p53蛋白沒(méi)有出現(xiàn)。然而，5一Fu和UV處理角質(zhì)形成細(xì)胞后，不僅出現(xiàn)MDMZ蛋白的表達(dá)上調(diào)，而且也出現(xiàn)p53蛋白的上調(diào);絲氨酸巧位磷酸化的p53蛋白的出現(xiàn)表明5一Fu和UV處理激活了P53蛋白的功能。IB:MDMZIB:P53業(yè)r15IB:P53IB:p·actin CNaAsO25· FuUV圖I一l砷劑對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞MDMZ、p53和絲氛酸巧位磷酸化的p53蛋白的影響泳道1:正常對(duì)照;泳道2:砷劑處理組;泳道3:5一Fu處理組;泳道4:UV處理組。 1.3.2砷劑上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞中MOMZ蛋白呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性1.3:21砷劑上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞中MDMZ蛋白的劑量反應(yīng)效應(yīng)如圖I一2所示，隨著砷劑的劑量逐漸增大，，角質(zhì)形成細(xì)胞中MDMZ蛋白的表達(dá)水平亦逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的劑量反應(yīng)依賴性(P<0.05)。

Beta一actinN叭 502(pmol幾): 00.5圖I一2不同劑量砷劑對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞MDMZ蛋白影響泳道1:正常對(duì)照組;泳道 2:0.5拼mo比砷劑處理24h;泳道3:1卜mof幾砷劑處理24h;泳道4:2林m。比砷劑處理24h。1.3.2.2砷劑上調(diào)MDMZ蛋白的時(shí)間反應(yīng)效應(yīng)如圖I一3所示，同樣是Zpmol幾砷劑處理，白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的時(shí)間反應(yīng)依賴性·隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，MDMZ蛋 (P<0.05)。{{{耀瓢薰馨馨 馨:MDMZ哪娜弊嘿攀拼~月IB:p一actin C12h24h圖I一3砷劑不同處理時(shí)間對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞Ml)MZ蛋白的影響泳道卜正常對(duì)照組;泳道2:2林mof幾砷劑處理12h;泳道3:2件mol幾砷劑處理24h。 1.3.3MDMZ上調(diào)介導(dǎo)砷劑誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細(xì)胞p53胞槳再分布1.3.3.1低濃度砷劑處理前后p53的亞細(xì)胞定位從圖I一4我們可以看出，5一Fu處理后皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中p53蛋白聚集在胞核內(nèi)，且其表達(dá)增強(qiáng)。與之不同的是，砷劑處理角質(zhì)形成細(xì)胞后，p53蛋白主要分布在胞漿。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R751

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