【摘要】：一、研究意義和目的 單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)屬于皰疹病毒科a病毒亞科，病毒顆粒大小約180納米。根據(jù)抗原性的差別目前把該病毒分為1型和2型。人群中HSV感染較為普遍，人是皰疹病毒的自然宿主。HSV-2型主要與外生殖器感染及新生兒感染有關(guān)，可引起生殖器皰疹、新生兒皰疹。通過醫(yī)學(xué)界近年來多方面的研究表明HSV-2與宮頸癌發(fā)生有關(guān)，并且增加了AIDS的感染機(jī)會。據(jù)1992年統(tǒng)計，美國每年有1200多萬STD新患者，生殖器皰疹病毒感染近20年增加15倍，累計人數(shù)超過2000萬，躍升為最流行的STD之一。從STD發(fā)展趨勢看，病毒和衣原體感染引起的STD比傳統(tǒng)的性病顯得更為重要，稱為第二代STD。如果說以前對傳統(tǒng)的性病易于治療的話，那么對日益劇增的第二代STD病原體，尤其是病毒性STD，其危害性不僅表現(xiàn)在診斷、治療上困難增大，而且并發(fā)癥和后遺癥也更為嚴(yán)重，直接威脅人類的生命健康。生殖器皰疹的臨床表現(xiàn)多種多樣，可表現(xiàn)為典型的水皰和糜爛，但不典型和亞臨床感染者更為多見，后者易被人們所忽視，成為重要的感染源。目前對于單純皰疹病毒感染的檢測手段有限，血清學(xué)方法標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)體結(jié)合技術(shù)不能鑒別HSV-1和HSV-2，傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)法費(fèi)時費(fèi)力。我們旨在建立基于HSV型特異的糖蛋白G(gG)的檢測HSV血清抗體的蛋白印跡試驗疫吸附試驗，為臨床中單純皰疹病毒的感染提供更快、更有效及明確的診斷方法。 大量研究表明，HSV病毒顆粒中有至少12種胞膜糖蛋白(glycoprotein g)，gB、gC、gD、gE／gI、gG、gH／gL、gK、gM／gN、gJ。其中g(shù)G攜帶有HSV型特異抗原決定簇，gG-2在單純皰疹2型病毒診斷、分型、疫苗研究中有舉足輕重的地位。gG-2由US4編碼，基因片段長度為2100bp，可以編碼699個氨基酸的蛋白質(zhì)。本研究分析了單純皰疹病毒Ⅰ型糖蛋白G-1和單純皰疹病毒Ⅱ型糖蛋白G-2的B細(xì)胞抗原表位，并用信息學(xué)軟件比較了兩者之間的基因差異。研究發(fā)現(xiàn)HSV-2的gG-2基因全長中包括一個與HSV-1的gG-1基因高度同源的區(qū)域和一個“獨(dú)特區(qū)”。gG-1基因和gG-2基因在“獨(dú)特區(qū)”中的同源性非常低。對gG-2蛋白的B細(xì)胞抗原表位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在gG-2蛋白中存在7段抗原指數(shù)以及表面可能性強(qiáng)的肽段相對集中區(qū)域。另有研究者發(fā)現(xiàn)，HSV-2的gG-2基因序列抗原區(qū)域極少突變，即使出現(xiàn)了點(diǎn)突變也不會削弱gG-2的血清學(xué)活性。該報告進(jìn)一步證實(shí)gG-2基因可以作為型特異性抗原，同時指出gG-2基因的保守性是作為HSV-2特異疫苗成分的先決條件。因此，本研究將靶蛋白抗原鎖定為gG-2的“獨(dú)特區(qū)”(gG-2_T)。對單純皰疹病毒gG-2_T進(jìn)行擴(kuò)增、克隆。在原核系統(tǒng)中表達(dá)，并對表達(dá)蛋白的蛋白進(jìn)行純化，對其抗原活性進(jìn)行初步研究。 二、研究方法和內(nèi)容 1、從臨床確診病人水皰部位取材、分離病毒并在Vero細(xì)胞中培養(yǎng)。 2、根據(jù)GenBank提供的單純皰疹病毒Ⅱ型糖蛋白G-2的基因組序列，，設(shè)計擴(kuò)增引物，上游的引物序列是“5′GAATTCatggcacgacccacggaagacg-3′”；下游的引物序列是5′-CTCGAG cggggttgcgggtccgg-3′。以Vero細(xì)胞病毒培養(yǎng)液上清提取的DNA為模板，擴(kuò)增gG-2基因，構(gòu)建克隆載體pGEM-T-G2，通過PCR鑒定。 3、從GenBank中下載單純皰疹病毒1型糖蛋白G-1序列，輸入LaserGene軟件包中的Editseq軟件中，截取gG-1基因片段，翻譯成氨基酸序列。利用Clustal X軟件將擴(kuò)增的gG-2基因與下載的gG-1基因片段核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比較。利用Proetean和DNAMAN軟件對單純皰疹病毒1型和2型的糖蛋白G進(jìn)行抗原表位、α螺旋中心以及疏水區(qū)域進(jìn)行預(yù)測，并比較它們之間的差異 4、根據(jù)序列分析結(jié)果，選定gG-2_T為目的序列。根據(jù)單純皰疹病毒333株gG-2基因序列設(shè)計引物，在引物兩端加上EcoRⅠ／XhoⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。以pGEM-T-G2質(zhì)粒為模板擴(kuò)增gG-2_T，得到pGEM-T-gG-2_T重組克隆載體。 5、將pGEX-4T-1載體與pGEM-T-gG-2_T分別經(jīng)過EcoRⅠ／XhoⅠ雙酶切后連接，構(gòu)建融合表達(dá)載體pGEX-4T-1-gG-2_T，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21，通過雙酶切，PCR方法鑒定后測序。 6、利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳及Western-blot分析對表達(dá)蛋白進(jìn)行初步鑒定。 7、優(yōu)化表達(dá)條件。將目的蛋白于上清表達(dá)，并使用GST親和純化試劑盒進(jìn)行表達(dá)蛋白的純化。 8、利用純化蛋白與單純皰疹病毒1型、2型病人血清以及正常人血清進(jìn)行Western blotting、間接EHSA反應(yīng)。 三、研究結(jié)果 1、Vero細(xì)胞變性，病毒成功地在Vero細(xì)胞中擴(kuò)增。 2、提取病毒DNA，擴(kuò)增單純皰疹病毒2型gG-2基因，gG-2基因全長2100bp，與單純皰疹病毒2型333株gG-2基因同源性為99.5％。以gG-2基因為模板，擴(kuò)增并克隆gG-2_T區(qū)，gG-2_T區(qū)序列大小為591bp，編碼197個氨基酸。 3、利用生物信息學(xué)軟件對Poly-Kyte-Doolittl親水性、Polt-Emini表面可能性、Jameson-Wolf抗原指數(shù)三參數(shù)綜合預(yù)測，結(jié)果顯示，HSV-2-G2蛋白C端的抗原指數(shù)較強(qiáng)。 4、通過優(yōu)化表達(dá)條件，pGEX-4T-1-gG-2_T可在大腸桿菌BL21中表達(dá)融合蛋白，分子量約為46KD。通過超聲裂解，表達(dá)的融合蛋白以上清的形式溶解在裂解液中。融合蛋白含有GST標(biāo)簽，可以通過GST親和純化柱進(jìn)行純化。 5、通過調(diào)整優(yōu)化條件，獲得純度較高的重組表達(dá)蛋白gG-2_T。蛋白的純化純度大于95％。 6、純化的目的蛋白能與GST多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，能與單純皰疹病毒2型病人血清反應(yīng)，而不與單純皰疹病毒1型病人血清發(fā)應(yīng)。故通過實(shí)驗得到我們需要的目的蛋白。 四、研究結(jié)論 鑒于預(yù)防、檢測和治療HSV感染的重要性，研制新型特異性診斷試劑盒以及開發(fā)疫苗是目前診斷和預(yù)防單純皰疹病毒感染的最可行有效的方法。前者能快速準(zhǔn)確診斷、鑒別初次感染和再次感染、用于大規(guī)模HSV感染的流行病篩查，后者能使機(jī)體在抗HSV感染免疫中，發(fā)揮體液免疫和細(xì)胞免疫功能來消除HSV感染。HSV-2包膜糖蛋白gG-2基因全長為2100bp，由US4基因編碼699個密碼子，包括一個與HSV-1包膜糖蛋白gG-1基因高度同源的區(qū)域和一個“獨(dú)特區(qū)”。通過對gG-1蛋白和gG-2蛋白的比對以及B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測我們發(fā)現(xiàn)，gG-1基因和gG-2基因在“獨(dú)特區(qū)”中的同源性非常低。Grabowsk等人利用噬菌體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)兩個位于gG-2“獨(dú)特區(qū)”內(nèi)的免疫顯位在氨基酸殘基的351-427、525-587內(nèi)，并通過試驗證明這兩段氨基酸殘基只與HSV-2型單純皰疹病毒反應(yīng)而不予HSV-1型單純皰疹病毒反應(yīng)。Ikoma等利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)gG-2(281aa～594aa)，檢測HSV-2型感染病人血清特異性抗體，特異性和敏感性達(dá)到95.5％。由此說明這兩段區(qū)域的肽段適合用作臨床抗體檢測，尤其適合用作HSV-2分型診斷。 研究發(fā)現(xiàn)，HSV-2的gG-2基因序列抗原區(qū)域極少突變，即使出現(xiàn)了點(diǎn)突變也不會削弱gG-2的血清學(xué)活性。該報告進(jìn)一步證實(shí)gG-2基因可以作為型特異性抗原，同時指出gG-2基因的保守性是作為HSV-2特異疫苗成分的先決條件。 本文采用分子克隆及基因重組技術(shù)成功構(gòu)建出HSV-2型gG-2_T(285～482aa)基因片段，利用原核表達(dá)載體表達(dá)出含有g(shù)G-2_T的融合蛋白，通過Western-Blot免疫印跡檢測表達(dá)蛋白能與GST多克隆抗體特異性結(jié)合。純化的蛋白即為我們需要的目的蛋白。間接ELISA證明表達(dá)的蛋白能夠與HSV-2陽性病人反應(yīng)而不與正常人血清和HSV-1病人血清反應(yīng)，表明原核表達(dá)的蛋白具有一定的免疫學(xué)活性。以上研究為單純皰疹病毒2型感染的型特異性診斷試劑盒的研發(fā)，生殖器皰疹篩查、型特異性疫苗研究尋找更好的靶位點(diǎn)提供參考。
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R752

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 周建勛,孟紅;單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-2)包膜糖蛋白gG-2相關(guān)研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊;2004年04期

2 賴偉紅;生殖器皰疹的流行病學(xué)及危險因素[J];國外醫(yī)學(xué).皮膚性病學(xué)分冊;1996年05期

3 賴偉紅;生殖器皰疹的預(yù)防與控制——問題和對策[J];國外醫(yī)學(xué).皮膚性病學(xué)分冊;1997年02期

4 賴偉紅;性傳播生殖器潰瘍性疾病與人類免疫缺陷病毒感染[J];國外醫(yī)學(xué)(皮膚性病學(xué)分冊);1998年05期

本文編號：2681189