發(fā)布時間：2020-05-17 14:11

【摘要】： 目的 用常規(guī)真菌學方法比較不同臨床型別的申克孢子絲菌分離株的真菌學特點,并了解中國遼寧地區(qū)的申克孢子絲菌線粒體DNA分型,探索其線粒體DNA分型與臨床表現(xiàn)型之間的關系。 材料與方法 一、實驗菌株 47例皮膚型孢子絲菌病患者均來自于本院皮膚科,皮損處組織塊或膿汁培養(yǎng)的致病菌經(jīng)大培養(yǎng)菌落形態(tài)特征和小培養(yǎng)鏡下特點鑒定為申克孢子絲菌,其中男16例,女31例,年齡2～86歲;固定型24例,淋巴管型23例。 二、實驗試劑 1、菌體培養(yǎng)基 (1)沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂固體培養(yǎng)基 (2)改良沙氏液基 2、線粒體DNA提取試劑 (1)EDTA緩沖液 (2)破壁酶Zymolyase 100T (3)2-巰基乙醇 (4)20%SDS(十二烷基磺酸鈉) (5)Tris飽和酚 (6)氯仿、異丙醇、無水乙醇 (7)TE緩沖液 3、酶切及電泳試劑 (1)HaeⅢ酶 (2)RNase A酶 (3)瓊脂糖 (4)0.5×TBE儲存液 三、主要實驗儀器 1、蒸汽高壓消毒箱(美國Tuttnauer 2540MK型) 2、PH4000AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司) 3、紫外凝膠成像系統(tǒng)(英國Gel WOrker eD,UVP GDS 8000) 4、全能型高性能臺式冷凍離心機(德國Heaeus,Biofuge Stratos) 5、05RP-22離心機(Hitachi提供) 6、HZO-X100震蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子開發(fā)有限公司) 7、電泳儀(北京六一儀器廠,DYY-Ⅲ2型) 8、電泳槽(北京六一儀器廠,DYY-Ⅲ2型) 9、超聲細胞破碎儀(up 50H ultraschallprozessor) 四、實驗方法 1、菌株培養(yǎng) 將47株分離菌株分別接種于沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂(SDA)固體培養(yǎng)基,2周后于菌體培養(yǎng)及鏡下觀察形態(tài)。 2、線粒體DNA提取 3、限制性酶切 4、瓊脂糖凝膠電泳并照相 結(jié)果 1、菌體培養(yǎng) 將47株孢子絲菌病分離菌株接種于沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂固體培養(yǎng)基,觀察發(fā)現(xiàn)47株申克孢子絲菌菌株基本一致: (1)SDA固體培養(yǎng)基示:1周時呈直徑約0.5cm菌落,淡褐色或白色平滑酵母樣菌落,表面濕潤成膜狀。2周時菌落直徑約2cm,中央凹陷,周邊隆起,出現(xiàn)皺褶,呈深褐色。 (2)鏡下示:細長分隔菌絲,分生孢子柄多與菌絲呈直角生長,頂端著生梨形或卵圓形孢子,呈梅花瓣狀分布,并見孢子沿菌絲側(cè)生。 2、線粒體DNA分型 對47株申克孢子絲菌進行線粒體DNA分型,得4,5,6,20及24型共五種帶型,由8或9條帶組成。這五個型別的共有帶分別為10kb、4.5kb、3.6kb、1.9kb、1.25kb、0.86kb和0.75kb。5型與20型的區(qū)別在于5型比20型多了一條0.96kb的帶;6型與24型的區(qū)別在于二者第二條帶的位置不同,即6型的第二條帶位于8.2kb處,而24型的第二條帶位于6.4kb處。 3、線粒體型別與臨床分型 (1)該47株申克孢子絲菌經(jīng)線粒體DNA分型,線粒體DNA 4型有40株,6型有3株,5型有1株,20型有1株,24型有2株。 (2)來源于臨床固定型的申克孢子絲菌菌株共有24株,4型有22株,余為6型;來源于臨床淋巴管型的申克孢子絲菌菌株共有23株,其中4型有18株,6型有1株,5型有1株,20型有1株,24型有2株。 4、統(tǒng)計學分析 (1)對申克孢子絲菌的線粒體DNA分型和孢子絲菌病的臨床型別進行統(tǒng)計分析,采用χ~2檢驗,P＜0.1,可認為申克孢子絲菌的臨床型別中的淋巴管型和固定型均與線粒體DNA分型中的4型相關。 (2)此外,就本實驗中的47例患者進行了臨床型別與性別之間的關聯(lián)假設,采用χ~2檢驗,P＞0.1,故可認為申克孢子絲菌病的臨床分型(淋巴管型和固定型)與患者性別之間無相關性。 本研究用常規(guī)真菌學方法對淋巴管型和固定型孢子絲菌病的致病菌株進行觀察比較,并研究了皮膚型孢子絲菌病的致病菌線粒體DNA分型與臨床型別之間的關系,得出以下結(jié)論:①用常用真菌形態(tài)學方法無法區(qū)分來源于不同臨床型別的申克孢子絲菌分離菌株。②淋巴管型和固定型孢子絲菌病與患者性別之間無明顯相關性。③中國遼寧地區(qū)的申克孢子絲菌由4、5、6、20及24型組成,4型在遼寧地區(qū)占有絕對優(yōu)勢。④線粒體DNA分型為4型的申克孢子絲菌菌株可能與淋巴管型及固定型孢子絲菌病有關,該型菌株在體內(nèi)是否更容易引起淋巴管型和固定型皮損有待進一步研究。
【圖文】：

(1)SDA固體培養(yǎng)基示:1周時呈直徑約0，scm菌落，淡褐色或白色平滑酵母樣菌落，表面濕潤成膜狀。2周時菌落直徑約Zcm，中央凹陷，周邊隆起，出現(xiàn)皺褶，呈深褐色，見圖1。(2)鏡下示:細長分隔菌絲，分生抱子柄多與菌絲呈直角生長，頂端著生梨形或卵圓形抱子，呈梅花瓣狀分布，并見抱子沿菌絲側(cè)生，見圖2。圖1，SDA固體培養(yǎng)基(左圖2，鏡下可見梅花瓣狀分生淋巴管型，右固定型)抱子2、線粒體DNA分型(1)對47株申克抱子絲菌進行線粒體DNA分型，得4，5

5型與20型的區(qū)別在于5型比20型多了一條0.%kb的帶;6型與24型的區(qū)別在于二者第二條帶的位置不同，，即6型的第二條帶位于8.Zkb處，而24型的第二條帶位于6.4kb處，見圖3。 4788692274灼93圖3，經(jīng)線粒體DNA分型得到的五種帶型:泳道1為mtDNA4型，泳道2為mtDNAZO型，泳道3為mtDNAS型，泳道4為mtDNA6型，泳道5為mtDNA24型，M:I又一EcoT4ldigesrDNAMarker。3、線粒體型別與臨床分型(1)該47株申克抱子絲菌經(jīng)線粒體DNA分型，線粒體DNA4型有40株
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R756.9;R450

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本文編號：2668679