【摘要】：惡性黑色素瘤是最致命的皮膚癌,臨床上對黑色素瘤的治療效果差強(qiáng)人意。被用于治療黑色素瘤的方法有很多,腫瘤免疫療法作為新一代療法一直備受關(guān)注。而其中,針對腫瘤抗原的特異性免疫療法已經(jīng)被證明可以在治療黑色素瘤上有較好療效。Survivin抗原是腫瘤相關(guān)抗原,是很有潛力的治療靶標(biāo),誘導(dǎo)其特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)可能對黑色素瘤起到一定的治療效應(yīng)。此外,GM-CSF和CCL17這兩種細(xì)胞因子可能對CTL功能的發(fā)揮起到重要的作用。因此,本論文研究Survivin特異性CTL聯(lián)合GM-CSF和CCL17的抗腫瘤作用,旨在為臨床上黑色素瘤的免疫治療提供一定的參考和幫助。第一部分Survivin抗原表位的生物信息學(xué)分析及體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過三個(gè)網(wǎng)站運(yùn)用生物信息技術(shù)分析鼠Survivin基因,隨后培養(yǎng)Survivin特異性淋巴細(xì)胞。方法:利用三個(gè)在線網(wǎng)站BIMAS(https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)、SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)和IEDB 3.0(http://www.iedb.org/)對鼠Survivin(Birc5)基因及編碼氨基酸全序列的9氨基酸表位肽進(jìn)行評分、預(yù)測,選擇評分較高的肽進(jìn)行合成,制成肽疫苗免疫正常小鼠,然后分離其脾臟淋巴細(xì)胞,誘導(dǎo)Survivin特異性CTL作用于小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10,并在培養(yǎng)體系中加入GM-CSF和CCL17蛋白。通過Calcein-AM法和流式細(xì)胞術(shù)檢測三者聯(lián)合對B16F10細(xì)胞的作用。結(jié)果:篩選出Survivin_(66-74)(GWEPDDNPI)和Survivin_(85-93)(AFLTVKKQM)兩個(gè)9肽,并成功誘導(dǎo)出了Survivin特異性CTL。而且,加入CCL17蛋白提高了CTL對B16F10的特異性裂解率,而加入GM-CSF蛋白則沒有顯著提高。結(jié)論:體外聯(lián)合Survivin特異性CTL和CCL17對B16F10細(xì)胞有更強(qiáng)的殺傷作用,而聯(lián)合GM-CSF并沒有增強(qiáng)CTL對B16F10細(xì)胞的殺傷作用。第二部分構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CCL17和GM-CSF的B16F10細(xì)胞系目的:構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CCL17和GM-CSF的B16F10細(xì)胞系,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。方法:設(shè)計(jì)GM-CSF和CCL17的引物,然后再通過一系列基因工程學(xué)的方法,將GM-CSF和CCL17基因?qū)氲紹16F10細(xì)胞中,并使其表達(dá)出來。結(jié)果:通過酶切、測序等等鑒定方法,我們證明了GM-CSF和CCL17被成功導(dǎo)入到表達(dá)載體中,并成功在B16F10細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)論:成功構(gòu)建表達(dá)CCL17和GM-CSF的B16F10細(xì)胞系,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。第三部分Survivin特異性CTL聯(lián)合CCL17和GM-CSF對小鼠黑色素瘤的影響目的:探討過繼性輸注Survivin特異性CTL聯(lián)合CCL17和GM-CSF對小鼠黑色素瘤的影響。方法:以小鼠黑色素瘤為模型,觀察三者聯(lián)合對腫瘤體積大小、腫瘤重量的影響,通過免疫染色和免疫組化等方法檢測腫瘤局部淋巴細(xì)胞的浸潤情況。結(jié)果:Survivin特異性CTL聯(lián)合CCL17和GM-CSF可以更好抑制腫瘤生長效果;HE染色和免疫組化顯示其腫瘤局部壞死的細(xì)胞最多,浸潤淋巴細(xì)胞也較多。結(jié)論:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明Survivin特異性CTL聯(lián)合GM-CSF和CCL17可以抑制小鼠黑色素瘤的生長。
【圖文】：

-200 雪花制冰機(jī) 圣海雪花制冰機(jī)廠20 臺式低速自動平衡離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限RTEX-5 漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限7520 高速冷凍離心機(jī) 美國 Thermo 公司天平 德國 Sartorius 公司器(P20, P100, P1000) 德國吉爾森長酶標(biāo)儀 美國 Thermo 公司法.1 鼠 Survivin 肽抗原表位的生物信息學(xué)分析.1.1 利用 BIMAS 對鼠 Survivin 進(jìn)行分析站輸入 https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/，可以看到：

廣東藥科大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文我們的目的是預(yù)測鼠 Survivin 抗原的 H2-Kd 限制性 CTL 表位，因此在中， 項(xiàng)目選擇 Kd，并且由于 9 肽常被用于此類實(shí)驗(yàn)，，所以在 選擇 9；在結(jié)果顯示 20 個(gè)，所以在中點(diǎn)擊 20。隨后，把 Survivin（Birc5）的氨基酸全序列粘貼復(fù)制進(jìn)入框中，點(diǎn)擊運(yùn)行。2.2.1.2 利用 SYFPEITHI 對鼠 Survivin 進(jìn)行分析在網(wǎng)頁中輸入 http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm，可以看到：
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.5

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本文編號：2667986