發(fā)布時(shí)間：2020-05-14 06:22

【摘要】： 毛發(fā)具有調(diào)節(jié)體溫、排泄代謝物、緩沖外界機(jī)械壓力等重要生理功能,對(duì)人類而言同時(shí)還有美學(xué)、裝扮、特征辨認(rèn)等社會(huì)學(xué)意義。因毛囊異常生長(zhǎng)所致的多毛或少毛現(xiàn)象不僅會(huì)影響毛發(fā)生理功能的正常發(fā)揮而且正在或可能將要給越來(lái)越多的患者造成心理壓力,直接影響他們的健康和生活質(zhì)量。研究表明,毛乳頭細(xì)胞(dermal papilla cells, DPCs)為位于毛囊基底部的含血管和神經(jīng)的間充質(zhì)成分,在毛囊胚胎發(fā)育和周期性生長(zhǎng)調(diào)控中起主導(dǎo)作用。誘導(dǎo)毛囊形成和凝集性生長(zhǎng)是毛乳頭細(xì)胞最為顯著的功能特征。毛乳頭細(xì)胞功能的異常是導(dǎo)致毛囊疾病的主要因素之一。了解毛囊生長(zhǎng)的確切機(jī)制、調(diào)控原理及探討臨床診治毛囊疾病的方法與措施是毛囊研究領(lǐng)域的重要課題。同時(shí),對(duì)毛乳頭細(xì)胞的生物學(xué)功能進(jìn)行研究也可為毛囊外組織和器官干細(xì)胞組織工程提供理論基礎(chǔ)。細(xì)胞在不同的生物學(xué)功能狀態(tài)下表達(dá)的基因不同,基因表達(dá)的多樣性、有序性、選擇性是細(xì)胞功能變化的內(nèi)在根據(jù)。因此,分析不同生長(zhǎng)狀態(tài)下毛乳頭細(xì)胞基因表達(dá)的情況,是了解毛乳頭細(xì)胞特性及毛囊疾病的基礎(chǔ)。 毛囊具有自我更新和周期性生長(zhǎng)的特性。完整的毛囊生長(zhǎng)周期包括生長(zhǎng)期(anagen)、退行期(catagen)、休止期(telogen)。毛乳頭細(xì)胞是組成毛乳頭的唯一細(xì)胞,在毛囊的胚胎發(fā)生和周期性生長(zhǎng)過(guò)程中起重要作用,一方面提供毛囊生長(zhǎng)和分化必需的信號(hào)因子和營(yíng)養(yǎng)支持,另一方面還決定毛囊的分化方向。毛乳頭是一個(gè)可誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu),它能發(fā)送或接受信號(hào),從而影響毛囊的發(fā)育和周期性生長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)小鼠/大鼠模型的研究,一些與毛囊生長(zhǎng)周期有關(guān)的調(diào)節(jié)分子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibobalast growth factors,FGFs)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)、刺猬蛋白(sonic hedgehog,Shh)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophins)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor,PDGF)等已相繼被鑒定出來(lái)。組成毛囊的細(xì)胞如毛乳頭細(xì)胞、外根鞘細(xì)胞(out root sheath,ORS)、毛母質(zhì)細(xì)胞等可分泌這些生長(zhǎng)因子及其受體;而且就單一細(xì)胞因子而言,其產(chǎn)生和分泌都與毛囊周期的特定時(shí)相有關(guān)。但是,關(guān)于這些細(xì)胞因子調(diào)節(jié)毛囊胚胎發(fā)生和毛囊生長(zhǎng)周期的具體分子機(jī)制如通過(guò)什么信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、與什么分子作用等尚不十分清楚。造血干細(xì)胞(hematopoietic stem/progenitor cell,HSPC)相關(guān)基因HSPC016是我國(guó)復(fù)旦大學(xué)學(xué)者在人造血干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的新基因,宋志強(qiáng)博士等使用抑制性消減雜交技術(shù)對(duì)凝集性生長(zhǎng)的毛乳頭細(xì)胞及非凝集性生長(zhǎng)狀態(tài)下毛乳頭細(xì)胞mRNA的表達(dá)差異進(jìn)行了研究,成功建立了毛乳頭細(xì)胞差異表達(dá)基因cDNA文庫(kù),為進(jìn)一步研究毛乳頭細(xì)胞功能調(diào)控的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。我科既往研究發(fā)現(xiàn)HSPC016基因作為上調(diào)表達(dá)基因在凝集性生長(zhǎng)狀態(tài)下人毛乳頭細(xì)胞差異表達(dá)基因cDNA文庫(kù)中表達(dá)并提示HSPC016基因在毛乳頭細(xì)胞生物學(xué)功能調(diào)控中有一定的作用。尚不能確定其具體的功能或調(diào)控途徑�；谝陨险J(rèn)識(shí),本課題擬對(duì)HSPC016基因在不同生長(zhǎng)狀態(tài)下人毛乳頭細(xì)胞中表達(dá)的生物學(xué)意義進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。 1. HSPC016基因的表達(dá)和純化 主要實(shí)驗(yàn)方法:按Genbank公布的HSPC016核酸序列,根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物,選擇合適的PCR反應(yīng)條件擴(kuò)增。T-A克隆后構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、免疫家兔。經(jīng)鎳離子親和層析純化法純化目的蛋白并對(duì)重組蛋白HSPC016進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PCR法擴(kuò)增得到了目的基因片段,片段大小約195bp與預(yù)期相符;原核表達(dá)質(zhì)粒pET-22b(+)/HSPC016經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定與GenBank公布的序列完全一致;轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)后經(jīng)IPTG誘導(dǎo),HSPC016重組蛋白的表達(dá)率約為28%;破菌上清經(jīng)SDS-PAGE鑒定表明,蛋白以可溶形式表達(dá);以鎳離子親和層析純化后純度95%;免疫家兔獲得了效價(jià)相對(duì)較高的免多抗血清,雙擴(kuò)及ELISA效價(jià)分別為1:16和1: 320,000 EU,免疫反應(yīng)性好。 2. McAb-HSPC016制備及特性分析 方法單克隆抗體的制備參照傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)方法進(jìn)行,將小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與HSPC016免疫的Balb/c小鼠的脾臟B淋巴細(xì)胞在聚乙二醇(PEG)作用下進(jìn)行細(xì)胞融合,ELISA法篩選出穩(wěn)定分泌抗HSPC016單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,將雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔誘生腹水以獲得大量單克隆抗體,并對(duì)其亞類及輕鏈型等進(jìn)行鑒定。SDS-PAGE鑒定IgG純度78.3%,ELISA法檢測(cè)腹水效價(jià),間接ELISA法測(cè)定抗體的親和常數(shù),Western blotting鑒定單克隆抗體特異性。結(jié)果獲得1株能穩(wěn)定分泌抗HSPC016抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A7B7D7,注入小鼠腹腔后,成功誘生大量腹水;雜交瘤單克隆細(xì)胞株A7B7D7分泌的單克隆抗體屬于IgG12a,輕鏈為к型;親和常數(shù)Ka為4.313×1010 (mol/L)-1;Western blotting結(jié)果表明,單抗A7B7D7能與人毛乳頭細(xì)胞中HSPC016形成單一的蛋白質(zhì)顯色條帶。 3. HSPC016蛋白部分生物學(xué)特性分析 方法用辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記HSPC016,建立定量檢測(cè)人HSPC016的含量方法,并初步應(yīng)用到正常人和禿發(fā)患者血清HSPC016的檢測(cè)。以我科建立的“二步酶”法分離毛乳頭,傳代培養(yǎng)至第10代,消化對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的第3代和第9代DPCs,調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105細(xì)胞/mL,接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入0.1mg/mL的HSPC016重組蛋白繼續(xù)培養(yǎng),于倒置顯微鏡下觀察;同時(shí),一組細(xì)胞采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),另一組細(xì)胞內(nèi)加入3H-TdR繼續(xù)孵育6h,消化收集細(xì)胞,檢測(cè)HSPC016重組蛋白對(duì)DPCs增殖的影響/作用。結(jié)果競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)結(jié)果初步顯示正常人血清中HSPC016的含量大于禿發(fā)患者(P0.01)。顯微鏡下觀察經(jīng)HSPC016重組蛋白處理過(guò)的DPCs增殖較活躍,生長(zhǎng)狀態(tài)好于對(duì)照組;流式細(xì)胞儀分析和3H-TdR檢測(cè)結(jié)果證實(shí)HSPC016重組蛋白能促進(jìn)第9代DPCs的增殖及其DNA合成,而對(duì)第3代DPCs則無(wú)明顯作用。 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的人HSPC016原核表達(dá)載體在大腸桿菌中得到了正確高效地表達(dá),并獲得純度較高的目的蛋白。以淋巴細(xì)胞雜交瘤單克隆抗體技術(shù)制備了抗人HSPC016鼠源性單克隆抗體。該單克隆抗體可用Western blotting等方法對(duì)細(xì)胞和組織中的HSPC016蛋白進(jìn)行特異性檢測(cè)。利用抗人HSPC016單克隆抗體通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)法初步檢測(cè)出正常人和禿發(fā)患者血清中HSPC016分布存在著差異。利用我科建立的“二步酶”法從人頭皮組織中成功分離出了DPCs,在體外傳代培養(yǎng)并用流式細(xì)胞儀和同位素標(biāo)記法大致分析了HSPC016重組蛋白在DPCs增殖中的作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HSPC016重組蛋白對(duì)高傳代DPCs的增殖有促進(jìn)作用。
【圖文】：

圖 1-1 pET-22b(+)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖fig 1-1. Scheme for the structure of the plasmid pET-22b(+)劑胨、酵母提取物 英國(guó) Oxoid 公司美國(guó) Sigma 公司Xho I 大連 Takara 公 Promega 公司 DNA 聚合酶 大連 Takara 公0 DNA Marker 大連 Takara 公試劑盒 Omega 公司提試劑盒 Omega 公司illin 國(guó)產(chǎn) 分析純

ET-22b(+)/HSPC016 序列測(cè)定果表明所擴(kuò)增的HSPC016基因ORF序列與GenBan附圖 1。DS-PAGE 檢測(cè) HSPC016 的表達(dá)程菌 pET-22b(+)/HSPC016/BL21(DE3)經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)情況(見圖 1-6)。與對(duì)照菌相比重組菌在條帶(箭頭所示)，，與推定目的蛋白 Mr 為 7255Da 基長(zhǎng)而增加，搖瓶條件下于 6h 時(shí)達(dá)到高峰，UVP 掃 28%。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R751

【參考文獻(xiàn)】

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1 伍津津,劉榮卿,唐書謙,鐘白玉,葉慶佾;正常人毛乳頭細(xì)胞和真皮鞘細(xì)胞的生長(zhǎng)特性觀察[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2000年12期

2 宋志強(qiáng),郝飛,楊希川,楊衛(wèi)兵,程波,麥躍,葉慶佾;人毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)差異表達(dá)基因cDNA文庫(kù)的構(gòu)建[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年11期

3 麥躍,劉榮卿,伍津津,程波,唐書謙,鐘白玉;毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)對(duì)誘導(dǎo)毛囊樣結(jié)構(gòu)形成能力的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2004年13期

4 麥躍,劉榮卿,伍津津;毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)與細(xì)胞DNA合成的研究[J];成都軍區(qū)醫(yī)院學(xué)報(bào);2002年02期

5 宋志強(qiáng),郝飛,鐘白玉,楊衛(wèi)兵,麥躍;體外長(zhǎng)期培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)特性[J];臨床皮膚科雜志;2003年05期

6 羅洋,郝飛,鐘白玉,麥躍,姜曉勇;人毛乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)蛋白作用下細(xì)胞VEGF的表達(dá)[J];中國(guó)美容醫(yī)學(xué);2004年03期

7 張春麗,趙世新,肖錫嶺,張景泉,王甲男,張耀庭,韓成新,李巖,張忠文,姜春來(lái),李武平,金梅艷,鄒平;表達(dá)α-2a干擾素工程菌的大型罐級(jí)聯(lián)控制溶氧發(fā)酵研究[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;1998年04期

8 曹軍平，閆桂玲，劉秀梵，張如寬;兩種簡(jiǎn)易高效的單克隆抗體提純方法[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;1995年02期

9 伍津津,劉榮卿,麥躍,程波,呂中法,魯元?jiǎng)?朱堂友;毛乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)毛囊形成的可能性研究(英文)[J];中國(guó)臨床康復(fù);2004年23期

10 程波,伍津津,劉榮卿,麥躍,鐘白玉,唐書謙;毛乳頭細(xì)胞與毛發(fā)上皮細(xì)胞相互作用的研究[J];中華皮膚科雜志;2000年06期

本文編號(hào)：2662943