【摘要】：背景和目的根據(jù)發(fā)病部位不同,膿皰性銀屑病基本上可分為兩型:泛發(fā)性膿皰性銀屑病和掌跖膿皰病。泛發(fā)性膿皰性銀屑病(generalized pustular psoriasis GPP)患者全身出現(xiàn)膿皰,可伴發(fā)熱,部分患者發(fā)病可能與IL36RN基因突變觸發(fā)異常炎癥反應(yīng)通路有關(guān)。IL36RN 基因(Interleukin-36 receptor antagonist gene)編碼 IL-36Ra 蛋白(Interleukin-36 receptor antagonist),IL-36Ra 是 IL-36 包括 IL-36y 的天然拮抗劑,IL-36Ra通過(guò)與IL-36R(IL-36 receptor)結(jié)合從而阻斷IL-36介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。IL36RN基因突變則導(dǎo)致IL-36Ra結(jié)構(gòu)功能異常,失去拮抗IL-36y能力,此時(shí)IL-36y可通過(guò)激活細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路使IL-8異常表達(dá)。IL-8是中性粒細(xì)胞活化及趨化因子,可募集中性粒細(xì)胞在表皮聚集形成膿皰。研究表明GPP患者血清中IL-8、IL-36y濃度較正常對(duì)照者明顯升高,皮損IL-8、IL-36γ較正常對(duì)照、扁平苔蘚等其他炎癥性皮膚病皮損明顯升高,而IL-36Ra表達(dá)水平明顯下降。掌跖膿皰病(palmoplantar pustulosis PPP)是一種主要局限于手掌、足跖的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病,皮損以紅斑、鱗屑及膿皰為特點(diǎn),有學(xué)說(shuō)認(rèn)為它是GPP的局限型。PPP流行病學(xué)資料有限,報(bào)道日本患病率為0.12%,好發(fā)于45-65歲女性。PPP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,現(xiàn)報(bào)道其發(fā)病與遺傳、免疫、汗腺汗管、IV型變態(tài)反應(yīng)、感染、甲狀腺疾病等相關(guān)。PPP患者皮損汗液分泌量較非皮損部位及健康對(duì)照者降低,汗管周?chē)嬖诮M織細(xì)胞、T細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。然而,PPP發(fā)病機(jī)制相關(guān)研究較缺乏。IL-8、IL-36γ、IL-36Ra在PPP發(fā)病機(jī)制中的作用尚無(wú)相關(guān)研究,中國(guó)PPP患者IL36RN基因突變情況也未見(jiàn)報(bào)道。因此,我們擬探索掌跖膿皰病患者皮損中IL-8,IL-36y,IL-36Ra與汗管在PPP發(fā)病中的所起的作用,以及中國(guó)PPP患者是否與泛發(fā)性膿皰性銀屑病一樣,存在IL36RN基因突變。研究對(duì)象收集2014年5月至2016年12月就診于北京協(xié)和醫(yī)院皮膚科門(mén)診經(jīng)臨床或病理確診的51例PPP患者外周血標(biāo)本及臨床資料,外周血標(biāo)本用于提取DNA,并通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增IL36RN基因外顯子及其側(cè)翼序列。選取其中17例PPP患者皮損組織用于免疫組織化學(xué)染色,并以14例尋常型銀屑病(psoriasis vulgaris PSV)患者皮損組織及12例正常皮膚作對(duì)照。此外,選取其中7例PPP患者皮損組織進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(RT-PCR),以8例PSV皮損組織及6例正常皮損組織作對(duì)照。留取皮損組織時(shí),PPP及PSV患者均處于疾病活動(dòng)期,就診前6周未進(jìn)行系統(tǒng)或局部治療。正常皮膚組織來(lái)自手術(shù)切除的掌跖色素痣邊緣正常皮膚。方法1.RT-PCR檢測(cè)患者皮損中IL-8、IL-36γ及IL-36Ra mRNA表達(dá)量:Trizol法提取新鮮皮膚組織總RNA。應(yīng)用試劑盒(GoscriptrM Reverse Transcription system)將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。使用 FastStart Universal SYBR Green 及 ABI 7500 Real-Time PCR進(jìn)行RT-PCR。瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。通過(guò)RT-PCR的擴(kuò)增及溶解曲線判斷擴(kuò)增效率,根據(jù)目的基因和內(nèi)參比值以2-△△Ct分別計(jì)算IL-8、IL-36γ及IL-36RamRNA的相對(duì)表達(dá)量。2.IL-8、IL-36γ、IL-36Ra及EMA免疫組織化學(xué)染色:石蠟包埋組織,4μm厚連續(xù)切片,免疫組織化學(xué)染色采用Envidion二步法,DAB顯色,不加一抗作陰性對(duì)照。免疫組化結(jié)果分析:由兩位醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行組織陽(yáng)性部位及染色強(qiáng)度進(jìn)行判讀。表皮IL-8、IL-36γ及IL-36Ra染色強(qiáng)度采用半定量方法評(píng)估:0=不著色,1=弱著色,2=中等著色,3=強(qiáng)著色。3.IL-36γ干預(yù)HaCaT細(xì)胞:體外培養(yǎng)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞株,應(yīng)用濃度分別為80、100及120ng/mlIL-36γ刺激細(xì)胞,并設(shè)置空白對(duì)照組。六孔板培養(yǎng)細(xì)胞,48h后收集HaCaT細(xì)胞提取總RNA,通過(guò)RT-PCR測(cè)定細(xì)胞中IL-8 mRNA的表達(dá)量;同時(shí)收集細(xì)胞上清,采用Elisa方法檢測(cè)上清液中IL-8表達(dá)水平。4.應(yīng)用試劑盒(AxyPrepBloodGenomic DNAMiniprepkit)提取 51 名 PPP 患者外周血基因組DNA,通過(guò)GenBank(NM_012275)獲取IL36RN基因序列,使用Primer 5設(shè)計(jì)7對(duì)引物。以患者DNA為模板,采用多聚酶鏈方法(polymerase chain reaction,PCR)方法擴(kuò)增IL36RN基因及其側(cè)翼序列,并進(jìn)行Sanger測(cè)序。分析患者DNA序列,使用SIFT/PolyPhen軟件預(yù)測(cè)突變蛋白的功能。結(jié)果1.IL-8mRNA在PPP皮損中的表達(dá)水平較PSV及健康對(duì)照者均明顯升高(P值均＜0.01);IL-36γmRNA在PPP皮損中的表達(dá)水平較正常對(duì)照及PSV均升高,與正常對(duì)照比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.01),與PSV比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.85)。IL-36Ra mRNA在PPP及PSV皮損中的表達(dá)水平較正常對(duì)照均明顯升高(P＜ 0.001P＜0.01),在PPP及PSV中的表達(dá)水平無(wú)明顯差異(p=0.286)。2.IL-8蛋白在PPP皮損中的表達(dá)水平較PSV及健康對(duì)照者均明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01P=0.04);IL-36γ蛋白在PPP皮損中的表達(dá)水平較正常皮損明顯升高(P=0.01),與PSV皮損比較無(wú)明顯差異(P=0.65);IL-36Ra蛋白表達(dá)水平在PPP,PSV及健康對(duì)照皮損中均無(wú)明顯差異(P均0.10)。3.PPP皮損膿皰中中性粒細(xì)胞IL-8染色強(qiáng)陽(yáng)性;PSV皮損中除Muro微膿瘍外,IL-8染色陰性;PPP皮損膿皰皰壁細(xì)胞及周?chē)琴|(zhì)形成細(xì)胞IL-36γ、EMA染色陽(yáng)性,兩者染色陽(yáng)性位置重疊。此外,真皮汗管細(xì)胞胞質(zhì)IL-36-γ染色陽(yáng)性。IL-36Ra在PPP、PSV及正常對(duì)照皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)。4.不同濃度(80ng/ml,100ng/ml,120ng/ml)IL-36y干預(yù)HaCaT細(xì)胞后,細(xì)胞IL-8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平及細(xì)胞上清液中IL-8分泌水平較空白對(duì)照組均升高,當(dāng)IL-36y培養(yǎng)濃度為1OOng/ml時(shí)升高最明顯,與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.03P=0.01)。5.51例PPP患者中,9例患者發(fā)生單堿基錯(cuò)義置換突變,共4種基因突變類(lèi)型。其中5例患者發(fā)生c.140AG/p.Asn47Ser,2例發(fā)生c.258GA/p.Met86IIe,1 例發(fā)生c.115+6TC及1例c.169GA/p.Va157IIe突變,所有患者均為雜合突變。與人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)及己報(bào)道致病突變基因比對(duì),這些突變位點(diǎn)在PPP患者中可能不存在致病性。且有突變及無(wú)突變PPP患者的疾病嚴(yán)重程度、發(fā)病年齡及病程均無(wú)明顯差異(P值均0.1)。結(jié)論1.PPP皮損中IL-8、IL-36γmRNA及蛋白表達(dá)水平均異常升高,IL-36Ra表達(dá)水平正常。IL-8、IL-36γ在PPP發(fā)病中起重要作用,IL-36Ra可能不是PPP的發(fā)病相關(guān)因素。2.PPP皮損膿皰可能于表皮頂端汗管處形成,并與IL-36γ、IL-8異常表達(dá)相關(guān)。汗管細(xì)胞可表達(dá)IL-36γ。3、IL-36γ可直接刺激人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞異常表達(dá)IL-8。4、51例中國(guó)PPP患者中未發(fā)現(xiàn)IL36RN基因明確致病突變,其發(fā)病與IL36RN基因突變可能不相關(guān)。
【圖文】：

圖３邋ＧＡＰＤＨ、ＩＬ－８基因?qū)崟r(shí)定量ＰＣＲ溶解曲線逡逑

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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R758.6

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本文編號(hào)：2662765