【摘要】：目的:皮膚鱗狀細(xì)胞癌(Cutaneous squamous cell carcinoma,CSCC)起源于表皮或附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞,是一種常見的皮膚惡性腫瘤。近年來發(fā)病率不斷升高,而目前對(duì)于皮膚鱗癌的治療,臨床上主要以手術(shù)為主,放射治療、光動(dòng)力療法、冷凍治療或多種方法的綜合療法也常用于臨床,手術(shù)聯(lián)合其他療法的效果可能會(huì)更明顯,但藥物治療的效果欠佳。隨著國(guó)內(nèi)外研究的不斷深入,新的抗腫瘤藥物及新的作用靶點(diǎn)不斷的被發(fā)現(xiàn),糖尿病一線用藥二甲雙胍作為老藥被新用,二甲雙胍被不斷的發(fā)現(xiàn)能作用于多種惡性腫瘤,例如乳腺、卵巢、結(jié)腸、前列腺等部位的惡性腫瘤,以及皮膚惡性腫瘤如惡性黑色素瘤、鱗狀細(xì)胞癌等。二甲雙胍抗腫瘤有多種作用機(jī)制,國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可通過多條信號(hào)通路來調(diào)控細(xì)胞能量代謝、抑制蛋白質(zhì)合成、誘導(dǎo)細(xì)胞周期停止、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,亦可與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)其他抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒性等,從而來達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的效果。粘著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是一種胞質(zhì)非受體蛋白酪氨酸激酶,是粘著斑復(fù)合物家族的一員。樁蛋白(PaxiIIin)是一種胞質(zhì)內(nèi)的關(guān)鍵銜接蛋白,是FAK下游的焦點(diǎn)黏附調(diào)節(jié)蛋白之一,主要定位于黏著斑�？烧{(diào)控多條下游信號(hào)通路,包括P13K/Akt、p53和RAS/Erk等,故FAK及Paxillin是胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中樞。阻斷FAK及Paxillin的活化及表達(dá)可以阻斷多條腫瘤增殖侵襲相關(guān)的信號(hào)通路,因此抑制FAK及Paxillin的表達(dá)、降低其活性有望成為腫瘤治療的一個(gè)新的作用靶點(diǎn)。二甲雙胍已經(jīng)被證明可以通過PI3K/Akt、RAS/Erk等信號(hào)通路抑制A431鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移,本實(shí)驗(yàn)研究旨在探討二甲雙胍對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的抑制作用及對(duì)FAK和Paxillin的磷酸化及轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響,探尋二甲雙胍對(duì)CSCC作用的新機(jī)制。方法:1.細(xì)胞來源:人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株A431細(xì)胞。2.實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)根據(jù)不同的藥物濃度分組,設(shè)IMDM培養(yǎng)基中二甲雙胍的濃度分別為1.25mM、2.5mM、5mM、10mM為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組,以不加藥物組為對(duì)照組。3.采用Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞在不同濃度的二甲雙胍作用24h后的遷移和侵襲的能力。4.采用蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot)技術(shù)檢測(cè)經(jīng)不同濃度的藥物處理的各組細(xì)胞中提取的總蛋白中FAK、p-FAK、Paxillin、p-Paxillin的蛋白相對(duì)表達(dá)量。5.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中FAK、Paxillin mRNA基因的轉(zhuǎn)錄情況。6.采用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中磷酸化的FAK及Paxillin表達(dá)情況。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料服從正態(tài)分布用?χ±s表示,并且方差齊時(shí)采用單因素方差分析;不服從正態(tài)分布用中位數(shù)及四分位數(shù)間距(m±q)表示,或方差不齊時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。兩兩比較方差齊時(shí)采用SNK-q檢驗(yàn),方差不齊采用Tamhan’S T2檢驗(yàn)。組間差異及兩兩比較均以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示二甲雙胍作用后的A431細(xì)胞其遷移和侵襲能力減弱:A431細(xì)胞經(jīng)二甲雙胍培養(yǎng)24h后,遷移實(shí)驗(yàn)中各組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為分別為113.0±14.32、85.33±6.46、83.44±7.47、71.89±7.22、60.56±4.21,除1.25mM與2.5mM組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P0.05),其余各組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);侵襲實(shí)驗(yàn)中各組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為91.44±4.10、78.78±4.99、67.11±4.83、58.22±5.43、38.22±8.67,各組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。兩組實(shí)驗(yàn)中穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)隨藥物濃度的升高而呈減少的趨勢(shì)。2.免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察經(jīng)二甲雙胍處理后的A431細(xì)胞中p-FAK及p-Paxillin在胞漿中的表達(dá)分布情況:二甲雙胍作用于細(xì)胞12小時(shí)后,可見細(xì)胞漿中p-FAK及p-Paxillin的表達(dá)隨藥物濃度的升高呈減弱的趨勢(shì)。3.藥物處理細(xì)胞12h后不同藥物濃度(0mM、1.25mM、2.5mM、5mM、10mM)對(duì)細(xì)胞總蛋白中p-FAK及p-Paxillin蛋白表達(dá)的影響:各組細(xì)胞p-FAK蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為:0.65±0.14、0.49±0.16、0.39±0.21、0.36±0.23、0.16±0.09;p-Paxillin蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為:0.56±0.07、0.45±0.09、0.29±0.14、0.19±0.08、0.11±0.1。各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。提示總蛋白中p-FAK及p-Paxillin的相對(duì)表達(dá)量隨藥物濃度的增加均呈下降的趨勢(shì)。4.經(jīng)二甲雙胍培養(yǎng)細(xì)胞12h后不同藥物濃度(0mM、1.25mM、2.5mM、5mM、10mM)對(duì)總蛋白中非磷酸化FAK及非磷酸化Paxillin表達(dá)的影響:各組FAK蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為:0.98±0.21、0.97±0.19、0.99±0.11、0.95±0.20、0.99±0.09;各組Paxillin蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為:1.01±0.17、1.08±0.16、0.98±0.12、0.95±0.09、1.12±0.21。兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示總蛋白中FAK及Paxillin的相對(duì)表達(dá)量隨藥物濃度的增加變化不明顯,說明二甲雙胍對(duì)其在A431細(xì)胞中的表達(dá)影響不明顯。5.利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)FAK mRNA、Paxiilin mRNA在不同二甲雙胍濃度(0mM、1.25mM、2.5mM、5mM、10mM)下的相對(duì)表達(dá)量:FAK mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、1.02±0.06、0.98±0.06、1.05±0.08、0.99±0.11,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Paxillin mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、1.05±0.05、1.03±0.08、1.04±0.04、1.09±0.12,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。提示FAK及Paxiilin mRNA的相對(duì)表達(dá)量隨藥物濃度的變化無明顯差異,可能二甲雙胍對(duì)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響不明顯。結(jié)論:1.二甲雙胍可抑制A431細(xì)胞的遷移及侵襲。2.二甲雙胍可抑制FAK及Paxillin的磷酸化,但對(duì)其轉(zhuǎn)錄及表達(dá)影響不明顯。
【學(xué)位授予單位】：承德醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 梁美琪;梁官釗;郭健;段昕所;陸潔;;二甲雙胍對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1誘導(dǎo)黑素瘤1205Lu細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲的影響[J];中華皮膚科雜志;2017年06期

2 梁官釗;李保強(qiáng);韓晨珠;許倩;楊寧;邢恩鴻;陸潔;;二甲雙胍和順鉑聯(lián)用對(duì)B16F10黑素瘤細(xì)胞的協(xié)同抑制效應(yīng)[J];中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志;2015年01期

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本文編號(hào)：2659580