【摘要】： 本文由5個部分組成:第一部分發(fā)現(xiàn)病例場所所用三氯乙烯成份分析;第二部分三氯乙烯藥疹樣皮炎患者部分免疫功能變化觀察;第三部分三氯乙烯染毒小鼠免疫功能變化研究;第四部分三氯乙烯藥疹樣皮炎與免疫相關(guān)基因易感性關(guān)系的研究;第五部分三氯乙烯藥疹樣皮炎患者基因表達(dá)變化的初步研究。 第一部分發(fā)現(xiàn)病例場所所用三氯乙烯成份分析 目的:選取部分三氯乙烯藥疹樣皮炎患者使用的三氯乙烯進(jìn)行全成份氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)檢測,檢測三氯乙烯及各種雜質(zhì)的含量,了解不同工廠使用的導(dǎo)致三氯乙烯藥疹樣皮炎的三氯乙烯是否存在共同雜質(zhì),為確定三氯乙烯致病機(jī)制提供依據(jù)。 方法:選取9個發(fā)生三氯乙烯藥疹樣皮炎工廠病人發(fā)病時使用的三氯乙烯,采用HP 6890/ 5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,抽取0.4ml三氯乙烯直接進(jìn)樣進(jìn)行全成份分析。在經(jīng)氣相色譜分離后,對離子流中每一峰的質(zhì)譜圖與譜庫中譜圖比對,與某物質(zhì)譜圖匹配率達(dá)90%以上時確定為該物質(zhì)。然后將所有樣品進(jìn)行匯總比較,觀察是否存在共同雜質(zhì)。如存共同雜質(zhì)則判斷其是否存在致敏可能。 結(jié)果:9個工作場所三氯乙烯樣品所含雜質(zhì)不盡相同,其中9個樣品共同的成份為三氯乙烯、1-1-2-三氯乙烷和四氯乙烯。另外,三氯甲烷、二甲苯和四氯化碳分別在約2/3樣品中檢出。 結(jié)論:綜合本次研究結(jié)果,所有樣品中除三氯乙烯外存在共同雜質(zhì):1-1-2-三氯乙烷和四氯乙烯,但尚未見二者引起致敏的報道。初步認(rèn)為三氯乙烯藥疹樣皮炎的過敏原是三氯乙烯可能性較大。 第二部分三氯乙烯致藥疹樣皮炎患者部分免疫功能變化 目的:通過對三氯乙烯致藥疹樣皮炎患者部分免疫功能指標(biāo)的觀察,了解三氯乙烯藥疹樣皮炎患者發(fā)病時機(jī)體部分變化情況,為探索發(fā)病機(jī)制提供線索。 方法:采集病人外周靜脈血進(jìn)行體外實驗。采用MTT法觀察患者淋巴細(xì)胞在加入三氯乙烯前后增殖情況差異;觀察患者白細(xì)胞在體外加入三氯乙烯后其移動范圍的變化以及將三氯乙烯藥疹樣皮炎患者CD4+/CD8+比值與正常對照進(jìn)行比較。 結(jié)果:三氯乙烯(40 mg/L及80mg/L)可顯著促進(jìn)三氯乙烯致藥疹樣皮炎患者淋巴細(xì)胞增殖(P0.05);該類患者CD4+/CD8+與正常對照組相比差異無顯著性意義;三氯乙烯對該類患者白細(xì)胞移動的抑制指數(shù)與對照組相比無顯著性差異。 結(jié)論:提示TCE可能是該類患者免疫反應(yīng)的抗原(或半抗原)。 第三部分三氯乙烯染毒小鼠免疫功能變化研究 目的:本部分研究應(yīng)用NIH小鼠染毒后,進(jìn)行小鼠足跖腫脹實驗和脾淋巴細(xì)胞增殖實驗等,觀察了三氯乙烯染毒小鼠免疫功能的變化,為探索三氯乙烯致敏作用提供依據(jù)。 方法:給予NIH小鼠皮下染毒三氯乙烯后,研究胸腺、脾、肝臟等臟器系數(shù)變化情況、進(jìn)行足跖腫脹實驗、脾淋巴細(xì)胞增殖實驗等。 結(jié)果:三氯乙烯染毒小鼠胸腺、脾臟器系數(shù)等未見明顯變化。24h、48h時小鼠足跖腫脹系數(shù)明顯高于對照組。80mg/L三氯乙烯可抑制對照組脾淋巴細(xì)胞的增殖,但可促進(jìn)TCE染毒小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖。 結(jié)論:三氯乙烯可能誘導(dǎo)NIH小鼠產(chǎn)生遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)。 第四部分三氯乙烯藥疹樣皮炎與免疫相關(guān)基因易感性關(guān)系的研究 目的:根據(jù)HLA-DM、HLA-DQA和Lag-3基因多態(tài)性在三氯乙烯藥疹樣皮炎和正常對照分布情況,探索三氯乙烯藥疹樣皮炎的易感性基因,為其危害防治提供依據(jù)。 方法:提取病例組(61例)及對照組(60例)淋巴細(xì)胞DNA,應(yīng)用降落式PCR擴(kuò)增,分別采用限制性片斷長度多態(tài)性檢測方法、直接測序或二者結(jié)合方法,確定其HLA-DM、HLA-DQA和Lag-3基因多態(tài)性,比較兩組之間三個基因的等位基因型和基因型出現(xiàn)頻率。 結(jié)果:病例組HLA-DMA*0101等位基因頻率明顯高于對照組(P0.05),病例組HLA-DMA*0102等位基因頻率明顯低于對照組。病例組HLA-DMB*0103等位基因頻率明顯高于對照組(P0.05)。其他等位基因型頻率在兩組之間均無顯著性差異。對照組HLA-DMA*0102-*0102純合子比例明顯高于病例組(P0.05),OR為3.86,CI為2.78-4.94。而對于HLA-DMB,病例組*0101-*0102雜合子比例明顯低于對照組(P0.05),OR為3.59,CI為2.71-4.47。其他HLA-DMA、DMB基因型頻率在兩組之間均無顯著性差異。 HLA-DQA等位基因型中,*0201頻率在病例組明顯高于對照組(P0.05)。*05頻率在病例組明顯低于對照組,但P值經(jīng)校正后大于0.05。 所有受檢的病例及對照Lag-3基因的exon1-6及exon-8序列與Genebank中序列一致,未發(fā)現(xiàn)缺失、突變及多態(tài)性情況。exon-7存在多態(tài)性,但其在兩組間分布情況差異無顯著性(P0.05)。 結(jié)論: HLA-DM基因、HLA-DQA基因多態(tài)性可能與三氯乙烯藥疹樣皮炎的易感性有關(guān)。Lag-3基因多態(tài)性可能與三氯乙烯藥疹樣皮炎的易感性無關(guān)。 第五部分三氯乙烯藥疹樣皮炎患者基因表達(dá)變化的初步研究 目的:了解三氯乙烯藥疹樣皮炎患者治療前后(治療后看作近似正常)基因表達(dá)譜是否存在差異,涉及哪些基因。進(jìn)而選取病人共同改變的部分基因,應(yīng)用熒光定量PCR方法在其他病人加以驗證。通過觀察三氯乙烯藥疹樣皮炎治療前后外周血淋巴細(xì)胞中基因表達(dá)改變,探索三氯乙烯藥疹樣皮炎涉及哪些基因及其病理過程。為研究三氯乙烯藥疹樣皮炎發(fā)病機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。 方法:收集12例病人入院及激素治療一個月后的外周血淋巴細(xì)胞,分別提取總RNA。其中2例應(yīng)用基因芯片檢測治療前后基因表達(dá)譜改變。然后比較兩例結(jié)果,找出其共有的改變。在基因芯片篩選出的共有差異表達(dá)基因中選取部分表達(dá)差異較大的10個基因在其他10個病人中加以驗證。 結(jié)果:將治療前后兩樣品信號強(qiáng)度間的比值(Ratio)大于2或小于0.5的數(shù)據(jù)作為有表達(dá)變化的基因數(shù)據(jù)。在506號病例中有基因表達(dá)改變317個,在治療前樣品中表達(dá)上調(diào)的基因有262個,下調(diào)表達(dá)的基因有55個;在507號病例中這類基因有591個,在治療前樣品中表達(dá)上調(diào)的基因有467個,下調(diào)表達(dá)的基因有124個。兩例同為上調(diào)的基因147個,同為下調(diào)的基因9個。從初步的結(jié)果分析來看,與細(xì)胞表面抗原、細(xì)胞因子以及免疫系統(tǒng)相關(guān)的基因有比較明顯的表達(dá)變化,其他具有明顯的功能類型特征的基因包括與蛋白質(zhì)合成及降解相關(guān)的基因表達(dá)的變化。 結(jié)論:初步研究顯示三氯乙烯藥疹樣皮炎病人病理過程中可能存在相似的基因表達(dá)改變,從而引發(fā)相同的病理過程。
【圖文】：

2.5mmol/L) 1.5μlfer（含 Mg2＋2.5mmol/L） 6μlDNA(150ng) 1.5μlu/μl) 0.8μl水 47.7μl積 60.0μl條件為：94℃預(yù)變性 3min，94℃變性 30sec0.5℃）、72℃延伸 1min(共 10 個循環(huán))，然后 、72℃延伸 1min(共 20 個循環(huán))，最后 72℃延糖凝膠電泳 30min（電壓為 10V/cm，EB 染色70bp,DMB 為 348bp 時，，再進(jìn)行酶切，如出現(xiàn)認(rèn)（圖 1）。

10×酶切緩沖液 1μl內(nèi)切酶 2.5U共 10μlHinfI、HhaI、Apal44I、AciI 酶切溫度為 37℃、滅活溫度 65℃；FokI 酶切溫度為 55℃、滅活溫度 80℃；BsrI 酶切溫度為 65℃、滅活溫度 80℃。所有酶切時間均為 3.5h。表 1 為各 DMA 及 DMB 被內(nèi)切酶酶切后判斷標(biāo)準(zhǔn)，其中 DMB-*0105 及*0106 為本研究新設(shè)計判斷標(biāo)準(zhǔn)。如酶切結(jié)果判斷存在疑問，再進(jìn)行直接測序。直接測序由上海博亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行，采用 ABI3730 測序儀進(jìn)行測序。用 8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離 2h，銀染后判定等位基因型和基因型。電泳參數(shù)：電壓為 12V/cm，5℃電泳 3h。銀染操作步驟根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]。銀染后透射掃描，分析結(jié)果（圖 2）。直接測序結(jié)果判斷見圖 3。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R758.25

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2638767