【摘要】：目的:使用白癜風(fēng)患者正常組織處的角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建表皮層,成纖維細(xì)胞構(gòu)建真皮層以及含有具有白癜風(fēng)患者特異性的誘導(dǎo)黑素細(xì)胞在體外運(yùn)用三維(3D)細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建的皮膚模型。方法:1.從一個(gè)正常人中提取三種皮膚原代細(xì)胞構(gòu)建具有個(gè)體化的正常皮膚模型。2.取白癜風(fēng)病人色素減退的皮損組織后分離出原代成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng),運(yùn)用誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞技術(shù)重編程為多功能干細(xì)胞(iPSC)后誘導(dǎo)分化為黑素細(xì)胞,將其與原代角質(zhì)形成細(xì)胞在體外進(jìn)行共培養(yǎng)。3.從白癜風(fēng)患者正常皮損出提取皮膚原代細(xì)胞以及和上述的誘導(dǎo)黑素細(xì)胞構(gòu)建體外色素皮膚模型。結(jié)果:1.使用Alvetex Scaffold小室構(gòu)建的個(gè)體化正常皮膚模型的具有角質(zhì)層,角化不明顯,真皮層不明顯;使用原代成纖維細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞株可以成功構(gòu)建全厚度的體外皮膚模型。2.黑素細(xì)胞在三維體外皮膚模型下DOPA染色呈現(xiàn)為陽(yáng)性,提示具有酪氨酸酶活性。3.使用I型鼠尾膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)可以構(gòu)建正常具有個(gè)體化皮層模型。4.誘導(dǎo)黑素細(xì)胞的生長(zhǎng)形狀和黑素基因相關(guān)蛋白表達(dá)與原代黑素細(xì)胞相似。5.誘導(dǎo)黑素細(xì)胞和原代角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)中其黑素小體具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能。6.含有白癜風(fēng)患者特異性的誘導(dǎo)黑素細(xì)胞在體外皮膚模型中酪氨酸酶活性有陽(yáng)性結(jié)果。結(jié)論:使用原代的表皮和真皮細(xì)胞運(yùn)用體外三維(3D)共培養(yǎng)技術(shù)可以構(gòu)建體外全厚度皮膚模型;由白癜風(fēng)患者皮膚皮損處來(lái)源的誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPSC)誘導(dǎo)出的黑素細(xì)胞在形態(tài)、蛋白表達(dá)、酪氨酸酶活性以及黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)功能上都與正常黑素細(xì)胞相似;使用白癜風(fēng)患者特異性的誘導(dǎo)黑素細(xì)胞,包含其患者正常的角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建的表皮層和成纖維細(xì)胞構(gòu)建的真皮層的體外皮膚模型,可以對(duì)后期構(gòu)建一個(gè)個(gè)體化的白癜風(fēng)皮膚模型奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.3.1 三種原代細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 15 天左右后，全部換液，在倒置顯微鏡下可觀察細(xì)胞貼附與培養(yǎng)皿底，胞核較大，細(xì)胞的形狀類(lèi)似為紡錘形扁平狀。繼續(xù)培養(yǎng)后該細(xì)胞生長(zhǎng)速度增快，形態(tài)均一，長(zhǎng)滿后傳代。傳代后的細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變（如圖A），原代黑素細(xì)胞培養(yǎng) 7-10 天后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞有樹(shù)枝狀的分叉，樹(shù)突細(xì)長(zhǎng)，折光性強(qiáng)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度一般，形態(tài)較均一（如圖 B），，細(xì)胞長(zhǎng)滿皿底 70%進(jìn)行傳代，傳代后細(xì)胞形態(tài)變化不大，隨著傳代次數(shù)增多，黑素細(xì)胞胞核變扁圓，中間有空泡，軸突增多，折光性差，原代角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng) 10 天左右可以看到胞核扁平，形態(tài)均一（如圖 C），每天換液可發(fā)現(xiàn)死細(xì)胞較多，傳代后細(xì)胞狀態(tài)可，細(xì)胞可發(fā)生鵝軟石樣疊加生長(zhǎng)。

來(lái)自白癜風(fēng)患者的誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（iPSC）分化的黑素細(xì)胞構(gòu)建三維皮膚模型的研究2.3.2 運(yùn)用Alvetex Scaffold 小室構(gòu)建體外皮膚模型2.3.2.1 不使用 I 型鼠尾膠原作為基質(zhì)層構(gòu)建全厚度皮膚模型使用 Alvetex Scaffold 小室將成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)后直接接種上培養(yǎng) 1 周，組織包埋切片后可以看到成纖維細(xì)胞均勻散在 Alvetex 的孔隙中構(gòu)成真皮層（如圖 A），構(gòu)建好真皮層后將 HaCaT 計(jì)數(shù)后接種在真皮層上培養(yǎng) 1 周，石蠟包埋切片后可看見(jiàn)完整的真皮層的同時(shí)也有完整的角質(zhì)層，角質(zhì)層細(xì)胞胞核均一，胞質(zhì)均一， 未有明顯角化（如圖 B）。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R758.41

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