【摘要】：背景與目的:創(chuàng)傷誘導(dǎo)毛囊新生是一種廣泛存在于成年哺乳類(lèi)動(dòng)物皮膚上的再生現(xiàn)象,即在一定大小的全層皮膚創(chuàng)傷愈合后的中心區(qū)域能夠新生出全功能性的毛囊。創(chuàng)傷后的毛囊新生的機(jī)制更類(lèi)似于胚胎源性的毛囊新生。表皮干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞及一些免疫細(xì)胞都參與了創(chuàng)傷后誘發(fā)毛囊新生的調(diào)控。對(duì)創(chuàng)傷誘導(dǎo)毛囊新生的研究有助于我們更深入的探索哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育及再生分子學(xué)機(jī)制,并且能夠指導(dǎo)臨床毛發(fā)相關(guān)疾病的治療。蛋白組學(xué)是在后基因組時(shí)代中崛起的新興學(xué)科,它能為揭示生命本質(zhì)的提供直接的物質(zhì)基礎(chǔ)。同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)是近年來(lái)研究蛋白組學(xué)最常用的的高通量篩選技術(shù)。它能夠定量分析兩組樣品蛋白的表達(dá)情況,進(jìn)而從篩選出的差異蛋白中尋找調(diào)控表型的靶點(diǎn)。在目前創(chuàng)傷誘導(dǎo)毛囊新生的研究中,炎癥因子的調(diào)控作用受到了較多關(guān)注。我們通過(guò)高通量的蛋白組學(xué)分析,篩選出預(yù)測(cè)能夠調(diào)控毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的蛋白質(zhì)分子,發(fā)現(xiàn)IL-36α在小鼠創(chuàng)傷愈合后的毛囊生長(zhǎng)區(qū)域高表達(dá)。IL-36α作為IL-1家族的前炎癥因子,能夠促進(jìn)多種炎癥因子,如IL-1、IL-6、TNFα等表達(dá)。因此本研究進(jìn)一步探討了IL-36α對(duì)創(chuàng)傷誘導(dǎo)毛囊新生的調(diào)控作用。材料與方法:1、創(chuàng)傷模型鼠建立:出生后49天大小雌性野生C57BL/6小鼠,背部造1.5cm×1.5cm方形全層創(chuàng)傷。2、阻礙傷口愈合對(duì)毛囊新生的影響:將20只創(chuàng)傷模型鼠隨機(jī)等分成2組,實(shí)驗(yàn)組用線將傷口邊緣與皮下肌肉組織縫合在一起,對(duì)照組不做處理。創(chuàng)傷后第0、3、5、7、10、14、22天數(shù)碼照相機(jī)拍照,統(tǒng)計(jì)傷口或愈合面積大小。創(chuàng)傷后第28天切取愈合區(qū)域皮膚組織,堿性磷酸酶染色,計(jì)數(shù)新生毛囊數(shù),觀察創(chuàng)傷后誘導(dǎo)新生毛囊的特點(diǎn)。3、創(chuàng)傷愈合區(qū)域中有毛囊新生區(qū)域與無(wú)毛囊新生區(qū)域蛋白組學(xué)的差異:45只創(chuàng)傷模型鼠,隨機(jī)等分成3組,取創(chuàng)傷后第15天小鼠背部瘢痕區(qū)域皮膚,分成內(nèi)、外組織兩部分,將每組的內(nèi)和外組織分別混合成一組樣品,共3對(duì)樣本進(jìn)行iTRAQ技術(shù)分析,對(duì)篩選出的差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)與創(chuàng)傷誘導(dǎo)毛囊新生相關(guān)蛋白分子進(jìn)行后續(xù)功能驗(yàn)證。4、IL-36α對(duì)創(chuàng)傷誘導(dǎo)毛囊新生和毛發(fā)生長(zhǎng)周期的作用:20只創(chuàng)傷模型鼠,隨機(jī)等分成PBS注射對(duì)照組和鼠源重組IL-36α(mr-IL-36α)注射實(shí)驗(yàn)組2組,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在創(chuàng)傷后第7-14天每日分別于痂下注射50μl PBS溶液或50μl mrIL-36α(1ng/μL,PBS配)溶液。觀察并拍照記錄創(chuàng)面愈合情況及毛囊新生情況,計(jì)數(shù)新生毛囊數(shù)量。49天和65天C57bl/6小鼠各5只,背部左側(cè)皮內(nèi)注射mr-IL-36α100μl,右側(cè)皮內(nèi)注射PBS 100μl。觀察并拍照記錄毛發(fā)生長(zhǎng)情況。5、通過(guò)qPCR、流式、免疫組化等方法探究IL-36α對(duì)表皮及毛囊干細(xì)胞、相關(guān)炎癥因子及Wnt經(jīng)典信號(hào)通路的調(diào)控。結(jié)果:1、創(chuàng)傷后第12-14天左右結(jié)痂脫落,測(cè)量創(chuàng)傷后第0、3、5、7、10、14、17、22天傷口或瘢痕的面積,阻礙傷口愈合組與對(duì)照組相比,其面積縮小的程度減慢。在創(chuàng)傷后第7、10、14、17、22天時(shí),兩組的創(chuàng)傷區(qū)域面積大小存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。創(chuàng)傷后第28天創(chuàng)傷愈合區(qū)中間存在新生毛囊,其數(shù)量與瘢痕面積的大小存在正相關(guān)性(rs=0.729,p0.001)。2、對(duì)創(chuàng)傷后第15天的創(chuàng)傷愈合區(qū)域進(jìn)行iTRAQ高通量蛋白分析技術(shù)分析,共檢測(cè)出4378個(gè)蛋白,無(wú)新生毛囊區(qū)與有新生毛囊區(qū)相比存在129個(gè)差異蛋白(差異倍數(shù)≥1.5 or≤0.667,p0.01),其中46個(gè)蛋白上調(diào),83個(gè)蛋白下調(diào)。GO分析示在生物學(xué)功能條目中,參與細(xì)胞過(guò)程的蛋白所占比例最高(58.14%),在細(xì)胞組成條目中,定位于細(xì)胞上的(包括細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、細(xì)胞外膜)蛋白所占比例最高(71.72%),在分子功能條目中,起到連接作用的蛋白所占比例最高(55.81%)。KEGG分析示富集在核糖體相關(guān)信號(hào)通路的蛋白最多。多個(gè)蛋白分子與毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān),其中IL-36α在有毛囊新生區(qū)域高表達(dá)(FC=0.556,p0.01)。3、IL-36α促進(jìn)創(chuàng)傷誘導(dǎo)毛囊新生及毛發(fā)周期轉(zhuǎn)化:創(chuàng)傷后第15天,qPCR檢測(cè)示IL-36αmRNA在有新生毛囊區(qū)的表達(dá)量是無(wú)新生毛囊區(qū)的26倍(p0.05);western blot檢測(cè)示,IL-36α在創(chuàng)傷愈合的中間區(qū)域即有毛囊新生區(qū)域高表達(dá)。IL-36α處理的創(chuàng)傷模型鼠在第10天左右脫痂,對(duì)照組在第12天左右脫痂,IL-36α處理組的創(chuàng)傷后誘導(dǎo)毛囊新生的數(shù)量高于對(duì)照組(p0.01)。毛發(fā)處于靜止期晚期小鼠,背部IL-36α處理區(qū)域毛囊進(jìn)入生長(zhǎng)期的時(shí)間早于PBS處理區(qū)域。4、IL-36α促進(jìn)表皮干細(xì)胞及毛囊干細(xì)胞增值:qPCR檢測(cè)IL-36α處理側(cè)K15、CD34、Lgr5和Lgr6的基因表達(dá)水平高于對(duì)照側(cè)(p0.05),流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)示,IL-36α處理側(cè)表皮細(xì)胞中CD49f~+CD34~+毛囊干細(xì)胞比例高于對(duì)照側(cè)(p0.05),CD34~-CD49f~+Pcad~(hi)毛囊前體細(xì)胞的比例無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。免疫熒光檢測(cè)示IL-36α處理部位K15表達(dá)水平高于對(duì)照側(cè)。免疫組化結(jié)果示IL-36α處理部位Lgr6表達(dá)水平高于對(duì)照側(cè)。5、IL-36α對(duì)經(jīng)典Wnt通路無(wú)調(diào)控作用但能上調(diào)β-catanin及相關(guān)炎癥因子表達(dá):qPCR檢測(cè)示IL-36α處理側(cè)TNFα、TCRVγ3、IL-6和β-catanin的基因表達(dá)水平高于對(duì)照側(cè)(p0.05),但其他Wnt相關(guān)因子,如LEF-1、Wnt5a、DKK-1、Lrp5,無(wú)明顯差異(p0.05)。western blot檢測(cè)示IL-36α處理部位STAT3磷酸化水平高于對(duì)照側(cè)。結(jié)論:1、阻礙傷口收縮使瘢痕的面積增大,促進(jìn)創(chuàng)傷誘導(dǎo)毛囊的生成。2、創(chuàng)傷誘導(dǎo)毛囊新生模型的新生毛囊主要集中在瘢痕中間區(qū)域,有毛囊新生區(qū)域與無(wú)毛囊新生區(qū)域具有蛋白表達(dá)的差異,其中IL-36α在有毛囊生長(zhǎng)區(qū)域高表達(dá)。3、IL-36α能夠通過(guò)促進(jìn)表皮干細(xì)胞及毛囊干細(xì)胞的增值促進(jìn)傷口愈合、創(chuàng)傷誘導(dǎo)毛囊新生及促進(jìn)靜止期晚期毛囊向生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)化。4、IL-36α通過(guò)促進(jìn)炎癥因子的分泌誘導(dǎo)了STAT3磷酸化及β-catanin相關(guān)通路激活,促進(jìn)了毛囊生長(zhǎng)。
【圖文】：

后天數(shù) 1 組 (cm2) 2 組(cm2)0 2.25 2.253 1.458±0.422 1.543±0.265 1.17±0.323 1.313±0.2087 0.609±0.173 0.913±0.11410 0.201±0.104 0.423±0.12914 0.184±0.098 0.319±0.18317 0.117±0.051 0.236±0.13522 0.079±0.042 0.184±0.06

5圖 2 第 1 組與第 2 組小鼠創(chuàng)傷愈合隨時(shí)間的變3.2 干預(yù)措施對(duì)創(chuàng)傷誘導(dǎo)毛囊新生的影響創(chuàng)傷后第 28 天，1 組瘢痕的面積平均值為 0.192±0.091平均值為 0.361±0.189 cm2（表 2）。新生毛囊的數(shù)量與瘢痕的p<0.001）（圖 3）。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R751

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7 孟亞奇;賈Z，

本文編號(hào)：2605883