【摘要】： 前言 表皮由角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes，KC)、朗格漢斯細(xì)胞(Langerhans cells，LC)、黑色素細(xì)胞、未定型細(xì)胞、Merkel細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等組成，其中KC占表皮細(xì)胞總數(shù)的95％左右，LC約占表皮細(xì)胞總數(shù)的2％-5％。 KC不僅在皮膚屏障功能中起著重要作用，同時也是皮膚免疫系統(tǒng)的重要組成部分。研究證明KC除了能產(chǎn)生許多細(xì)胞角蛋白及粘多糖等保持皮膚生化及物理的完整性外，還產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如：IL-1、IL-6、IL-7、IL-8、TNF-α、GM-CSF、IL-3、TGF等，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞和LC活性。 人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞系是由Norbert E．Fusenig從正常人皮膚分離出的第一個永久性人角質(zhì)形成細(xì)胞系。目前，HaCaT細(xì)胞系細(xì)胞被認(rèn)為是在體外培養(yǎng)中自發(fā)轉(zhuǎn)變的、可永久傳代的非腫瘤性細(xì)胞。 LC能捕獲外來抗原，并將其遞呈給引流淋巴結(jié)內(nèi)的T細(xì)胞。LC因其抗原遞呈功能而被認(rèn)為對維持皮膚免疫的自身平衡有重要的作用，但其功能易受內(nèi)外環(huán)境因子影響。新分離的(或位于表皮內(nèi)的)LC可以激活異體T細(xì)胞，但不能激活自身未致敏的(naive)淋巴細(xì)胞。當(dāng)在培養(yǎng)液中加入GM-CSF后，培養(yǎng)的LC表面的MHC Ⅰ、Ⅱ類抗原明顯增加，并可表達(dá)多種對未致敏T細(xì)胞有協(xié)同刺激作用的因子，如B7、ICAM-1、CD40及IL-1β。同時，LC的功能也發(fā)生變化，可以在體外激活自身T細(xì)胞，即功能上由不成熟向成熟轉(zhuǎn)變。但局部或周身給予外源性GM-CSF卻不能誘導(dǎo)表皮LC在表皮內(nèi)發(fā)生功能轉(zhuǎn)變。同時發(fā)現(xiàn)，患有可以分泌GM-CSF的腫瘤的小鼠血中GM-CSF水平雖然很高，但其表皮內(nèi)的LC卻沒有“培養(yǎng)后的”表型，也沒有抗原遞呈功能。謝勇等認(rèn)為在血清中存在一種可以抑制LC受GM-CSF作用而發(fā)生功能轉(zhuǎn)變的因子。經(jīng)分析，確定這種分子就是結(jié)合珠蛋白(haptoglobin，Hp)(α_1鏈)。 Hp是一種α_2-唾液酸糖蛋白(α_2-sialoglycoprotein)，分布于人及其他哺乳動物的大部分體液內(nèi)。Hp主要在肝臟合成，在脂肪組織、肺及其他 多種組織中也可以合成。Hp是一種活躍的急性期蛋白(acute phase pro- tein)，在炎癥、各種病因的感染、創(chuàng)傷、組織損傷及惡性腫瘤時血漿內(nèi)飾 水平明顯升高，但在血管內(nèi)溶血及肝功能衰竭時血漿水平明顯下降。 謝勇等用免疫熒光雙標(biāo)記法觀察到表皮LC內(nèi)有Hp蛋白。并且，他們 還發(fā)現(xiàn)如果將含有LC的表皮放在培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)幾天，LC內(nèi)的Hp蛋白會 迅速減少，除非向培養(yǎng)基內(nèi)加人人血清或Hp純品。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示LC 可能自身不能合成Hp。 但是，，有關(guān)人皮膚(表皮、真皮)中Hp mRNA或蛋白表達(dá)研究目前尚未 見報(bào)告。D’A二iento等曾發(fā)現(xiàn)在小鼠全層皮膚中有Hp mRNA表達(dá)，但沒 有進(jìn)一步明確其在表皮及真皮中的分布。 為了明確正常人皮膚是否有合成Hp的能力，我們做了如下工作: 1.用RT一PCR法檢測了14例正常人皮膚(表皮及真皮)中Hp mRNA 表達(dá); 2.用原位雜交方法檢測了Hp mRNA在正常人表皮各種細(xì)胞中的表 達(dá); 3.用RT一PCR及原位雜交法分別檢測了Hp mRNA在人KC細(xì)胞系 HaCaT細(xì)胞中的表達(dá); 4.用免疫組織化學(xué)法及Westem免疫印跡法檢測了正常人表皮及 HaCaT細(xì)胞中Hp蛋白的表達(dá)。 材料和方法 一、標(biāo)本資料: (一)正常人皮膚標(biāo)本:22例正常人皮膚標(biāo)本均取自于整形美容手術(shù) 中。 1.用于RT一PCR的標(biāo)本14例。部位:包皮3例，面部4例，胸部5例， 腹部1例，臀部1例。其中，男7例，女7例。年齡:29一54歲，平均年齡: 39.8歲。 2.用于原位雜交及免疫組織化學(xué)染色的標(biāo)本8例。部位:面部3例， 胸部5例。其中，男3例，女5例。年齡:22一51歲，平均年齡:38.875歲。 (二)HacaT細(xì)胞:是1 988年由Fusenig等從正常人軀干皮膚中分離并 培育的人KC細(xì)胞系，2000年10月由何春滌教授從德國Free Universityof Beilin引進(jìn)并凍存于液氮中。使用前復(fù)蘇并培養(yǎng)1周，取1 xl護(hù)個細(xì)胞用 于實(shí)驗(yàn); (三)肝HePGZ細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院龔非力教授于2001年 6月惠贈，凍存于液氮內(nèi)。使用前復(fù)蘇并培養(yǎng)1周，取1 xl護(hù)個細(xì)胞用于實(shí) 驗(yàn)。 二、RNA提取及翩A濃度測定: 1.皮膚組織RNA提取:用EDTA一N、液分離表皮及真皮，用Trizol總 RNA提取試劑盒提取各份表皮、真皮標(biāo)本總RNA。 2.細(xì)胞RNA提取:分別取1 x106個HacaT細(xì)胞及1 xl護(hù)個肝H叩G2 細(xì)胞，用Trizol總RNA提取試劑盒提取各份細(xì)胞總RNA。 3.提取的RNA用紫外分光光度儀測定在260nln及Zsorun處的光密度 (oPtic滋density，oD)值，并根據(jù)此OD值計(jì)算RNA的濃度和純度。 三、引物設(shè)計(jì): Hp引物采用以人Hpp鏈cDNA序列為模板設(shè)計(jì)的一對引物，產(chǎn)物大 小為197bp; PCR內(nèi)對照采用人p一球蛋白(p一globin)引物對GHZo/PC04，產(chǎn)物大 小為286bpo 四、RT一PCR: 1.用Rav逆轉(zhuǎn)錄酶將各份表皮、真皮及HaCaT細(xì)胞、肝HePGZ細(xì)胞總 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA; 2，用Hp引物對及GH20/PC04引物對，PCR擴(kuò)增各份表皮、真皮及 HaCaT細(xì)胞、肝HepGZ細(xì)胞的eDNA; 3.設(shè)立陰性對照:用各份標(biāo)本的RNA代替模板cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增; 4.設(shè)立空白對照:用滅菌雙蒸水代替模板cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。.
【圖文】：

人表皮、真皮cDNACH20/PC04PCR反應(yīng)產(chǎn)物286b:標(biāo)本cDNAG甩O/PC04PCR反應(yīng)產(chǎn)物286bp片照，9:空白對照2000bP一1000bP一500bP一250bP一2HepGZ肝細(xì)胞系細(xì)胞RNART一PCR擴(kuò)增片段量標(biāo)準(zhǔn);1.Hp197bp片段:2.GHZO/PC04286bp片3.空白對照;4.陰性對照;

正常人表皮細(xì)旅色染色為飾m孫認(rèn)場陽性.孫認(rèn)原位雜交結(jié)果(x400)，細(xì)地膜上藍(lán)染為cDI
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號】：R751

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2599746