【摘要】： 前言 表皮由角質形成細胞(keratinocytes，KC)、朗格漢斯細胞(Langerhans cells，LC)、黑色素細胞、未定型細胞、Merkel細胞、淋巴細胞等組成，其中KC占表皮細胞總數(shù)的95％左右，LC約占表皮細胞總數(shù)的2％-5％。 KC不僅在皮膚屏障功能中起著重要作用，同時也是皮膚免疫系統(tǒng)的重要組成部分。研究證明KC除了能產(chǎn)生許多細胞角蛋白及粘多糖等保持皮膚生化及物理的完整性外，還產(chǎn)生多種細胞因子，如：IL-1、IL-6、IL-7、IL-8、TNF-α、GM-CSF、IL-3、TGF等，調節(jié)淋巴細胞和LC活性。 人角質形成細胞HaCaT細胞系是由Norbert E．Fusenig從正常人皮膚分離出的第一個永久性人角質形成細胞系。目前，HaCaT細胞系細胞被認為是在體外培養(yǎng)中自發(fā)轉變的、可永久傳代的非腫瘤性細胞。 LC能捕獲外來抗原，并將其遞呈給引流淋巴結內的T細胞。LC因其抗原遞呈功能而被認為對維持皮膚免疫的自身平衡有重要的作用，但其功能易受內外環(huán)境因子影響。新分離的(或位于表皮內的)LC可以激活異體T細胞，但不能激活自身未致敏的(naive)淋巴細胞。當在培養(yǎng)液中加入GM-CSF后，培養(yǎng)的LC表面的MHC Ⅰ、Ⅱ類抗原明顯增加，并可表達多種對未致敏T細胞有協(xié)同刺激作用的因子，如B7、ICAM-1、CD40及IL-1β。同時，LC的功能也發(fā)生變化，可以在體外激活自身T細胞，即功能上由不成熟向成熟轉變。但局部或周身給予外源性GM-CSF卻不能誘導表皮LC在表皮內發(fā)生功能轉變。同時發(fā)現(xiàn)，患有可以分泌GM-CSF的腫瘤的小鼠血中GM-CSF水平雖然很高，但其表皮內的LC卻沒有“培養(yǎng)后的”表型，也沒有抗原遞呈功能。謝勇等認為在血清中存在一種可以抑制LC受GM-CSF作用而發(fā)生功能轉變的因子。經(jīng)分析，確定這種分子就是結合珠蛋白(haptoglobin，Hp)(α_1鏈)。 Hp是一種α_2-唾液酸糖蛋白(α_2-sialoglycoprotein)，分布于人及其他哺乳動物的大部分體液內。Hp主要在肝臟合成，在脂肪組織、肺及其他 多種組織中也可以合成。Hp是一種活躍的急性期蛋白(acute phase pro- tein)，在炎癥、各種病因的感染、創(chuàng)傷、組織損傷及惡性腫瘤時血漿內飾 水平明顯升高，但在血管內溶血及肝功能衰竭時血漿水平明顯下降。 謝勇等用免疫熒光雙標記法觀察到表皮LC內有Hp蛋白。并且，他們 還發(fā)現(xiàn)如果將含有LC的表皮放在培養(yǎng)液內培養(yǎng)幾天，LC內的Hp蛋白會 迅速減少，除非向培養(yǎng)基內加人人血清或Hp純品。以上實驗結果提示LC 可能自身不能合成Hp。 但是，，有關人皮膚(表皮、真皮)中Hp mRNA或蛋白表達研究目前尚未 見報告。D’A二iento等曾發(fā)現(xiàn)在小鼠全層皮膚中有Hp mRNA表達，但沒 有進一步明確其在表皮及真皮中的分布。 為了明確正常人皮膚是否有合成Hp的能力，我們做了如下工作: 1.用RT一PCR法檢測了14例正常人皮膚(表皮及真皮)中Hp mRNA 表達; 2.用原位雜交方法檢測了Hp mRNA在正常人表皮各種細胞中的表 達; 3.用RT一PCR及原位雜交法分別檢測了Hp mRNA在人KC細胞系 HaCaT細胞中的表達; 4.用免疫組織化學法及Westem免疫印跡法檢測了正常人表皮及 HaCaT細胞中Hp蛋白的表達。 材料和方法 一、標本資料: (一)正常人皮膚標本:22例正常人皮膚標本均取自于整形美容手術 中。 1.用于RT一PCR的標本14例。部位:包皮3例，面部4例，胸部5例， 腹部1例，臀部1例。其中，男7例，女7例。年齡:29一54歲，平均年齡: 39.8歲。 2.用于原位雜交及免疫組織化學染色的標本8例。部位:面部3例， 胸部5例。其中，男3例，女5例。年齡:22一51歲，平均年齡:38.875歲。 (二)HacaT細胞:是1 988年由Fusenig等從正常人軀干皮膚中分離并 培育的人KC細胞系，2000年10月由何春滌教授從德國Free Universityof Beilin引進并凍存于液氮中。使用前復蘇并培養(yǎng)1周，取1 xl護個細胞用 于實驗; (三)肝HePGZ細胞由華中科技大學同濟醫(yī)學院龔非力教授于2001年 6月惠贈，凍存于液氮內。使用前復蘇并培養(yǎng)1周，取1 xl護個細胞用于實 驗。 二、RNA提取及翩A濃度測定: 1.皮膚組織RNA提取:用EDTA一N、液分離表皮及真皮，用Trizol總 RNA提取試劑盒提取各份表皮、真皮標本總RNA。 2.細胞RNA提取:分別取1 x106個HacaT細胞及1 xl護個肝H叩G2 細胞，用Trizol總RNA提取試劑盒提取各份細胞總RNA。 3.提取的RNA用紫外分光光度儀測定在260nln及Zsorun處的光密度 (oPtic滋density，oD)值，并根據(jù)此OD值計算RNA的濃度和純度。 三、引物設計: Hp引物采用以人Hpp鏈cDNA序列為模板設計的一對引物，產(chǎn)物大 小為197bp; PCR內對照采用人p一球蛋白(p一globin)引物對GHZo/PC04，產(chǎn)物大 小為286bpo 四、RT一PCR: 1.用Rav逆轉錄酶將各份表皮、真皮及HaCaT細胞、肝HePGZ細胞總 RNA逆轉錄為cDNA; 2，用Hp引物對及GH20/PC04引物對，PCR擴增各份表皮、真皮及 HaCaT細胞、肝HepGZ細胞的eDNA; 3.設立陰性對照:用各份標本的RNA代替模板cDNA進行PCR擴增; 4.設立空白對照:用滅菌雙蒸水代替模板cDNA進行PCR擴增。.
【圖文】：

人表皮、真皮cDNACH20/PC04PCR反應產(chǎn)物286b:標本cDNAG甩O/PC04PCR反應產(chǎn)物286bp片照，9:空白對照2000bP一1000bP一500bP一250bP一2HepGZ肝細胞系細胞RNART一PCR擴增片段量標準;1.Hp197bp片段:2.GHZO/PC04286bp片3.空白對照;4.陰性對照;

正常人表皮細旅色染色為飾m孫認場陽性.孫認原位雜交結果(x400)，細地膜上藍染為cDI
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2002
【分類號】：R751

【共引文獻】

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本文編號：2599746