【摘要】： 目的本研究選擇人表皮組織為研究對象。1.建立適合人表皮組織的雙向電泳技術、獲得質量優(yōu)良的人表皮蛋白質組雙向電泳圖譜。2.篩選并分析中年人表皮中與皮膚光老化相關的蛋白質。 方法1.取人皮膚標本20例(部位:包皮),將表皮用DispaseⅡ與真皮分離,提取人表皮組織總蛋白,以17cm固相pH梯度膠條(pH3～10)進行雙向電泳,將硝酸銀染色后的雙向電泳凝膠予以掃描,使用PDQuest8.0圖像分析軟件對其進行強度校正、點檢測、定量、凝膠匹配、背景扣除、ID校正等,并對實驗的重復性進行分析,對樣品制備、上樣量、等電聚焦參數(shù)及硝酸銀染色等關鍵步驟進行改進優(yōu)化。2.將取自中年人的皮膚標本40例(年齡45～59歲),分為曝光組(20例;部位:面部、頭皮)及非曝光組(20例;部位:臀部、會陰部),使用方法1中建立的技術平臺分離兩組的表皮總蛋白,PDQuest8.0圖像分析軟件分析、對比兩組2-DE圖譜,檢測出組間差異表達的蛋白點,并通過MALDI-TOF-MS及數(shù)據(jù)庫檢索來鑒定差異候選蛋白。 結果1.獲得了分辨率高、重復性好且清晰的人表皮雙向電泳圖譜,分離出500余個蛋白點;本實驗重復3次,所得圖譜非常相似,膠間匹配率為85.5%。分離出蛋白點551±31個,主要分布在分子量14～100KD、pH5～8之間;所得蛋白點數(shù)量適中、分辨率高,無條紋及背景干擾。2.曝光組2-DE凝膠圖譜上獲得蛋白點587±14個,非曝光組534±15個。共檢測出組間差異表達的蛋白點32個—⑴非曝光組,特異表達:3個;高表達:9個。⑵曝光組,特異表達:6個;高表達:14個。隨機選取3個在曝光組差異表達的蛋白質點進行鑒定,鑒定結果為:B2:P21活化激酶6( p21-activated kinase 6,PAK6),B4:谷胱甘肽轉移酶P1-1(Glutathione transferase P1-1,GSTP1-1),B6:熱休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)。 結論通過對關鍵技術進行改進,獲得了高分辨率和高重復性的人表皮2-DE凝膠圖譜。建立了適合人表皮蛋白質組學研究的技術平臺,為尋找皮膚光老化標志物奠定基礎。日光慢性積累性輻射自然生長的人表皮,能夠引起其蛋白質組發(fā)生相應改變。已鑒定的3個差異蛋白極有可能在人皮膚光老化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著極其重要的作用,甚至可能成為皮膚光老化的臨床診斷標志物。
【圖文】：

423±29 9.5 μg/μl 1-B1-A 1-B圖１ 兩種樣品制備方法的 2-DE 圖譜Fig 1 2-DE maps of two methods of sample preparation

不同上樣量所得的 2-DE 圖譜（見表 2、圖 2）取組 1 的樣品，以 3 種不同上樣量進行 2-DE。上樣量為 250 μg（見圖 2蛋白斑點顯示清晰、分離良好、數(shù)量適中；200 μg（見圖 2-B）時，圖譜整斑點數(shù)量少，許多低豐度蛋白未清晰顯示；300 μg（見圖 2-C）時，高豐互相融合，連接重合成片，遮蓋其它蛋白點�？梢� 250 μg 為最佳上樣量。表 2 三種上樣量及結果Table 2 Three sorts of protein quantities and results組別 上樣量(μg)IEF 參數(shù) 圖譜200 2-B1250 2-A300Ｉ2-C
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R758.1

【參考文獻】

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本文編號：2549853