【摘要】：研究背景:惡性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是一種全世界發(fā)病率越來越高的侵襲性腫瘤,占皮膚惡性腫瘤的7%～20%,其惡性程度高,易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及分泌轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-beta,TGF-p)等抑制性因子,因此一旦轉(zhuǎn)移即難以根治。近年在卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、骨髓瘤及黑色素瘤等多種腫瘤的研究中證實(shí)有腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cell,TSC)或癌干細(xì)胞(cancer stem cell,CSC)存在,并認(rèn)為CSC是腫瘤拮抗放化療、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。因此,從理論上分析,消滅CSC即能控制腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,消除其耐藥性和對化療的拮抗。傳統(tǒng)的手術(shù)治療、放療、化療因不能靶向CSC而致使患者治療后五年生存率不甚理想,由此可見尋找新的治療策略非常重要。腫瘤免疫治療是通過激活體內(nèi)的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對腫瘤有效遏制的臨床治療手段,因其能誘導(dǎo)靶向腫瘤細(xì)胞的多種免疫效應(yīng)機(jī)制而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。多種免疫治療手段的有效性已在臨床前期實(shí)驗(yàn)和臨床治療中得到證實(shí),如淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、細(xì)胞因子治療和抗體治療等。其中腫瘤的治療性疫苗也取得了可喜的進(jìn)展,但由于腫瘤抗原免疫原性弱、腫瘤免疫逃逸、腫瘤的異質(zhì)性等原因,疫苗的實(shí)際療效與預(yù)期仍有差距,因而尋找腫瘤疫苗研制新的突破點(diǎn)尤為重要。目前有觀點(diǎn)認(rèn)為CSC可能富聚多種腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原,CSC疫苗可能會激發(fā)宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生靶向CSC的免疫反應(yīng),所以黑色素瘤CSC疫苗是一個(gè)值得研究的免疫治療策略。研究目的:探討表達(dá)黑色素瘤B16F10 CD133+CD44+CSCs瘤苗治療黑色素瘤的效應(yīng)及其機(jī)制。研究方法:利用免疫磁珠分選技術(shù)分離出B16F10CD133+CD44+CSCs,取5x105個(gè)細(xì)胞經(jīng)MMC滅活后免疫C57BL/6小鼠,每次間隔10天,共免疫三次。末次免疫后10天,以1x105個(gè)B16F10野生株細(xì)胞攻擊免疫鼠。同時(shí)設(shè)B16F10非癌干細(xì)胞組和B16F10野生株組為對照,以上述同樣方法免疫和攻擊小鼠。觀察各組小鼠腫瘤生長情況、生存時(shí)間,并檢測免疫小鼠血清細(xì)胞因子TGF-p、IFN-γ和IL-4的表達(dá)水平、脾細(xì)胞和NK細(xì)胞毒活性。同時(shí)以QPCR法和Western-Bolt法檢測了分離的B16F10 CD133+CD44+CSCsCB1B1101癌干細(xì)胞、B16F10野生株以及小鼠體內(nèi)移植瘤組織中NY-ESO-1、PD-1和WISP-2等相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。研究結(jié)果:1.B16F10CD133+CD44+CSCs瘤苗免疫組的小鼠成瘤率,腫瘤體積,腫瘤生長速度均較普通瘤苗組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.B16F10 CD133+CD44+CSCs瘤苗免疫組小鼠血清的IFN-y和脾NK細(xì)胞毒和脾細(xì)胞毒活性均較對照組瘤苗高,同時(shí)TGF-p水平降低、IFN-γ水平上升并且IFN-γ/IL-4比值升高。3.QPCR分析相關(guān)蛋白的DNA水平顯示,B16F10 CD133+CD44+ CSCs中NY-ESO-1和PD-1高表達(dá),WISP-2低表達(dá)。4.Western-bolt分析B16F10 CD133+CD44+CSCs瘤苗免疫組小鼠腫瘤組織中NY-ESO-1和PD-1均低表達(dá),而WISP-2蛋白卻是高表達(dá)。結(jié)論:本研究制備的B16F10CD133+CD44+CSCs瘤苗,能有效的誘導(dǎo)抗B16F10的特異性細(xì)胞免疫與體液免疫反應(yīng),顯示出有效的抗腫瘤效應(yīng),其機(jī)制可能與通過表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原蛋白而調(diào)控信號通路蛋白相關(guān)。本研究為CD133+CD44+CSCs瘤苗治療黑色素瘤提供可供參考的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
【圖文】：

圖２雙抗夾心ＥＬＩＳＡ法檢測瘤苗免疫小鼠后各組Ｆｉｇ．２邋Ｔｈｅ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋ｓｅｒｕｍ邋ＩＦＮ－ｙ邋ｉｎ邋ｍｉｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄＣＳＣｓ：邋ＣＤ邋１３３＋ＣＤ４４＋ＣＳＣｓ瘤苗免疫組；ＷＴ：邋Ｂ１６腫瘤干細(xì)胞免疫組。＊戶＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１。逡逑４．邐Ｂ１６Ｆ１０邋ＣＤ１３３＋ＣＤ４４＋邋ＣＳＣｓ瘤苗免疫鼠ＥＬＩＳＡ檢測血清ＴＧＦ－ｐ表達(dá)水平差異，結(jié)瘤苗、ｎｏｎ－ＣＳＣｓ瘤苗和Ｂ１６Ｆ１０野生株瘤苗有明顯的差異，如圖３所示。ＣＳＣｓ瘤苗免疫ｎｏｎ－ＣＳＣｓ瘤苗組（Ｐ＜０．０１），與野生株Ｂ１６Ｆ（戶＜０＿０５）。逡逑□邋ＣＳＣｓ邋％邐＂逡逑枈邋ＷＴ邋」＊邋＂Ｉ邋＊邐＊＊逡逑■邋Ｎｏｎ－ＣＳＣｓ邋Ｊ邋＊邋－逡逑２．５－｜逡逑２．０－逡逑＿

ＥＬＩＳＡ檢測血清ＴＧＦ－ｐ表達(dá)水平差異，結(jié)果顯示，Ｂ１６Ｆ１０ＣＤ１３３＋ＣＤ４４＋邋ＣＳＣｓ逡逑瘤苗、ｎｏｎ－ＣＳＣｓ瘤苗和Ｂ１６Ｆ１０野生株瘤苗在免疫后５天血清中ＴＧＦ－卩分泌水平逡逑有明顯的差異，如圖３所示。ＣＳＣｓ瘤苗免疫組小鼠血清中ＴＧＦ－Ｐ水平顯著低于逡逑ｎｏｎ－ＣＳＣｓ瘤苗組（Ｐ＜０．０１），，與野生株Ｂ１６Ｆ１０瘤苗組之間相比也有顯著性差異逡逑（戶＜０＿０５）。逡逑□邋ＣＳＣｓ邋％邐＂逡逑枈邋ＷＴ邋」＊邋＂Ｉ邋＊邐＊＊逡逑■邋Ｎｏｎ－ＣＳＣｓ邋Ｊ邋＊邋－逡逑２．５－｜逡逑２．０－逡逑＿卜ｈ鰣義希簦櫻垮危掊義稀ｅ澹義賢跡沖澹牛蹋桑櫻良觳飭雒緱庖吆笮∈笱逯校裕牽疲興藉義希疲椋紓沖澹牛蹋桑櫻鈴澹簦镥澹洌澹簦澹悖翦澹螅澹潁酰礤澹歟澹觶澹歟簀澹錚駑澹裕牽疲繡澹椋鑠澹恚椋悖邋義希茫櫻茫螅哄澹茫模保常常茫模矗矗茫櫻茫罅雒緱庖咦�；ＷＴ：邋n保叮疲保耙吧炅雒緱庖咦椋唬危錚睿茫櫻茫螅悍清義現(xiàn)琢齦上赴庖咦欏＃校跡埃埃擔(dān)澹校跡埃埃�。辶x希擔(dān)危攏保叮疲保板澹茫模保常常茫模矗矗澹茫櫻茫罅雒緱庖呤笱逯校桑疲危耍桑蹋幢戎瞪咤義希玻插義

本文編號：2538632