【摘要】： 目的:作為皮膚的附屬器官,毛發(fā)具有重要的生理學(xué)與社會學(xué)功能。毛發(fā)缺失或分布異常給患者帶來很大的心理負擔(dān)。目前對毛發(fā)生長機制的研究主要集中于毛囊。毛乳頭細胞(Dermal papilla cell,DPC)是位于毛囊基底部的一群真皮源性細胞,它們是一簇特化的成纖維細胞(specialized fibroblast),其顯著的生物學(xué)特性為體內(nèi)外表現(xiàn)為凝集性的生長方式及體內(nèi)外具有誘導(dǎo)毛囊形成的能力,并在毛囊的形態(tài)學(xué)發(fā)生及其周期性生長調(diào)控中處于中心環(huán)節(jié)。而在多次傳代后,這種特性就會消失。毛乳頭細胞的生物學(xué)作用是通過一系列信號分子通路、多種細胞生長因子完成的。胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)結(jié)構(gòu)與胰島素類似,能刺激黑素細胞、上皮細胞及毛囊的生長。成纖維細胞生長因子7(fibroblast growth factor7,FGF7)又稱角質(zhì)形成細胞生長因子,可刺激角質(zhì)形成細胞和其它上皮細胞的增殖。 毛乳頭細胞不僅對誘導(dǎo)和維持毛囊的周期性循環(huán)必不可少,毛乳頭的大小也決定了毛囊的大小和毛囊生長期的長短。甘草是傳統(tǒng)中藥養(yǎng)發(fā)生發(fā)產(chǎn)品中使用頻率較高的藥物和添加成分,其主要成分為甘草酸,甘草提取物可促進體外培養(yǎng)的鼠觸須毛囊生長。復(fù)方甘草酸苷(商品名:美能)的主要成分為甘草酸苷即β-甘草酸,被廣泛用于皮膚病和肝病的治療。臨床實驗發(fā)現(xiàn)復(fù)方甘草酸苷對斑禿治療有效,其誘導(dǎo)毛發(fā)生長的機制尚不明確,其對體外培養(yǎng)的人毛乳頭細胞的作用還未見報道。糖皮質(zhì)激素應(yīng)用于斑禿治療迄今已有60余年的歷史,是目前治療斑禿最為常用、可靠及有效的方法之一。其主要機制可能與抗炎及免疫抑制有關(guān),但對人毛乳頭細胞的作用還未見報道。 為觀察體外毛乳頭細胞的生物學(xué)特性,及其與IGF-1和FGF7的關(guān)系,復(fù)方甘草酸苷和地塞米松對毛乳頭細胞的影響,我們對人頭皮毛乳頭進行分離培養(yǎng),并檢測兩種生長因子分別在凝集性、非凝集性生長的毛乳頭細胞中的表達,以及IGF-1和復(fù)方甘草酸苷、地塞米松對毛乳頭細胞增殖的影響,為臨床篩選刺激毛囊及毛發(fā)生長的藥物提供實驗基礎(chǔ)。 方法: 1毛乳頭細胞的分離培養(yǎng) 采用“二步酶消化法”分離培養(yǎng)正常人毛乳頭,觀察體外培養(yǎng)毛乳頭細胞形態(tài)和生長情況,并行α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)免疫組化染色鑒定。 2采用免疫組化法分別檢測第3代和第9代培養(yǎng)的毛乳頭細胞IGF-1、FGF7蛋白的表達水平。 3采用流式細胞儀分別檢測第3代和第9代培養(yǎng)的毛乳頭細胞IGF-1、FGF7蛋白的表達水平,及細胞周期變化和凋亡情況。 4 MTT比色分析法檢測不同濃度IGF-1(2.5～100ng/ml)對人毛乳頭細胞增殖的影響。 5 MTT比色分析法檢測不同濃度復(fù)方甘草酸苷(0.5～100μg/ml)對人毛乳頭細胞增殖的影響。 6 MTT比色分析法檢測不同濃度地塞米松(0.5～100μg/ml)對人毛乳頭細胞增殖的影響。 7運用統(tǒng)計軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理,采用t檢驗、單因素方差分析,以α=0.05為差異顯著性標(biāo)準。 結(jié)果: 1人毛乳頭細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 1.1人毛乳頭細胞的分離、培養(yǎng) 經(jīng)“二步酶消化法”得到的毛乳頭,在倒置顯微鏡下觀察呈圓形或橢圓形,第二天即可見貼壁,貼壁1天后可觀察到細胞遷出,向四周呈放射狀生長。2～3周后細胞大部分生長融合,低倍鏡下可見細胞呈漩渦狀生長,有多層凝集趨勢,細胞呈長梭形。細胞消化傳代后第2天可見細胞貼壁展開,隨著細胞數(shù)目增多,又融合形成多層凝集性生長。細胞傳代后增殖速度也加快,尤以3～5代細胞最為顯著,且均可見凝集性生長。隨毛乳頭細胞傳代次數(shù)增加,凝集性逐漸消失,細胞變?yōu)槎鄻O、梭形或細長的成纖維細胞樣,生長速度變慢,傳代周期明顯延長。 1.2人毛乳頭細胞的鑒定 人毛乳頭細胞α-SMA免疫組化染色呈陽性。 2免疫組織化學(xué)S-p法分別檢測3代、9代細胞IGF-1和FGF7的表達 IGF-1與FGF7均表達于細胞胞漿,著色由黃色到褐色不等。3代和9代毛乳頭細胞免疫組化染色后IGF-1表達分別為+～++和+;FGF7表達分別為+～++和±～+。 3流式細胞儀分別檢測3代、9代毛乳頭細胞IGF-1、FGF7的表達 流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示,3代、9代毛乳頭細胞IGF-1的均道值分別為270.98±26.84、232.14±14.80,前者大于后者,但統(tǒng)計分析表明兩者相比無顯著性差異(P0.05)。3代、9代毛乳頭細胞FGF7的均道值分別為373.51±24.97、270.91±32.83,前者大于后者,統(tǒng)計學(xué)分析表明兩者有顯著性差異(P0.05)。 4流式細胞儀檢測人毛乳頭細胞凋亡及細胞周期分布 3代和9代毛乳頭細胞處于G1期的細胞比率分別為55.53±3.34%、57.53±6.84%;處于S期的細胞比率分別為34.87±3.18%、34.10±6.36%;處于G2期的細胞比率分別為7.82±3.37%、8.40±3.19%。各期細胞兩者比較均無明顯差異(P0.05)。兩組細胞的凋亡率分別為1.36±0.24%、1.28±0.63%,無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。 5 IGF-1對人毛乳頭細胞增殖的影響 處于對數(shù)生長期的第4代毛乳頭細胞加入不同濃度的重組人IGF-1培養(yǎng)72h后,MTT結(jié)果顯示與對照組相比,各濃度組均有明顯促進毛乳頭細胞增殖的作用(P0.05),其中以2.5ng/ml最為顯著,其余各組間無明顯差異,濃度再增加,促增殖作用并不增強。 6復(fù)方甘草酸苷對人毛乳頭細胞增殖的影響 處于對數(shù)生長期的第4代毛乳頭細胞加入不同濃度的復(fù)方甘草酸苷培養(yǎng)72h后,MTT結(jié)果顯示在0.5～20μg/ml濃度內(nèi),促增殖作用呈劑量依賴性,以20μg/ml組刺激作用最強,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),濃度再增加,其促增殖作用反而減弱。 7地塞米松對人毛乳頭細胞增殖的影響 在處于對數(shù)生長期的第4代毛乳頭細胞中加入不同濃度的地塞米松培養(yǎng)72h后,MTT結(jié)果顯示在0.5～2.5μg/ml濃度內(nèi),促增殖作用呈劑量依賴性,以2.5μg/ml組刺激作用最強,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),濃度再增加,其促增殖作用有所減弱。 結(jié)論: 1二步酶消化法可簡便、快捷、有效地分離獲得毛乳頭。體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞在6代之前呈明顯的凝集性生長特性,繼續(xù)傳代該特性逐漸消失。 2凝集性與非凝集性生長的毛乳頭細胞各細胞周期與凋亡均無明顯差異,表明體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞維持在比較穩(wěn)定的增殖狀態(tài)。 3 FGF7在凝集性生長的毛乳頭細胞中表達明顯高于非凝集性生長的毛乳頭細胞,推測凝集性生長的毛乳頭細胞促進毛母質(zhì)細胞增殖角化可能與FGF7有關(guān)。 4 IGF-1可明顯刺激毛乳頭細胞增殖,同時受毛乳頭細胞表面的IGF結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)。IGF-1在凝集性生長的毛乳頭細胞中表達高于非凝集性生長的毛乳頭細胞,但無統(tǒng)計學(xué)差異,IGF-1促進毛囊生長的機制有待進一步探討。 5復(fù)方甘草酸苷和地塞米松在抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抑制的同時還可能通過調(diào)節(jié)毛乳頭細胞的活性,誘導(dǎo)毛發(fā)生長。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R751

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