【摘要】： 目的:作為皮膚的附屬器官,毛發(fā)具有重要的生理學(xué)與社會(huì)學(xué)功能。毛發(fā)缺失或分布異常給患者帶來很大的心理負(fù)擔(dān)。目前對(duì)毛發(fā)生長機(jī)制的研究主要集中于毛囊。毛乳頭細(xì)胞(Dermal papilla cell,DPC)是位于毛囊基底部的一群真皮源性細(xì)胞,它們是一簇特化的成纖維細(xì)胞(specialized fibroblast),其顯著的生物學(xué)特性為體內(nèi)外表現(xiàn)為凝集性的生長方式及體內(nèi)外具有誘導(dǎo)毛囊形成的能力,并在毛囊的形態(tài)學(xué)發(fā)生及其周期性生長調(diào)控中處于中心環(huán)節(jié)。而在多次傳代后,這種特性就會(huì)消失。毛乳頭細(xì)胞的生物學(xué)作用是通過一系列信號(hào)分子通路、多種細(xì)胞生長因子完成的。胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)結(jié)構(gòu)與胰島素類似,能刺激黑素細(xì)胞、上皮細(xì)胞及毛囊的生長。成纖維細(xì)胞生長因子7(fibroblast growth factor7,FGF7)又稱角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子,可刺激角質(zhì)形成細(xì)胞和其它上皮細(xì)胞的增殖。 毛乳頭細(xì)胞不僅對(duì)誘導(dǎo)和維持毛囊的周期性循環(huán)必不可少,毛乳頭的大小也決定了毛囊的大小和毛囊生長期的長短。甘草是傳統(tǒng)中藥養(yǎng)發(fā)生發(fā)產(chǎn)品中使用頻率較高的藥物和添加成分,其主要成分為甘草酸,甘草提取物可促進(jìn)體外培養(yǎng)的鼠觸須毛囊生長。復(fù)方甘草酸苷(商品名:美能)的主要成分為甘草酸苷即β-甘草酸,被廣泛用于皮膚病和肝病的治療。臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)復(fù)方甘草酸苷對(duì)斑禿治療有效,其誘導(dǎo)毛發(fā)生長的機(jī)制尚不明確,其對(duì)體外培養(yǎng)的人毛乳頭細(xì)胞的作用還未見報(bào)道。糖皮質(zhì)激素應(yīng)用于斑禿治療迄今已有60余年的歷史,是目前治療斑禿最為常用、可靠及有效的方法之一。其主要機(jī)制可能與抗炎及免疫抑制有關(guān),但對(duì)人毛乳頭細(xì)胞的作用還未見報(bào)道。 為觀察體外毛乳頭細(xì)胞的生物學(xué)特性,及其與IGF-1和FGF7的關(guān)系,復(fù)方甘草酸苷和地塞米松對(duì)毛乳頭細(xì)胞的影響,我們對(duì)人頭皮毛乳頭進(jìn)行分離培養(yǎng),并檢測(cè)兩種生長因子分別在凝集性、非凝集性生長的毛乳頭細(xì)胞中的表達(dá),以及IGF-1和復(fù)方甘草酸苷、地塞米松對(duì)毛乳頭細(xì)胞增殖的影響,為臨床篩選刺激毛囊及毛發(fā)生長的藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法: 1毛乳頭細(xì)胞的分離培養(yǎng) 采用“二步酶消化法”分離培養(yǎng)正常人毛乳頭,觀察體外培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞形態(tài)和生長情況,并行α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)免疫組化染色鑒定。 2采用免疫組化法分別檢測(cè)第3代和第9代培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞IGF-1、FGF7蛋白的表達(dá)水平。 3采用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)第3代和第9代培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞IGF-1、FGF7蛋白的表達(dá)水平,及細(xì)胞周期變化和凋亡情況。 4 MTT比色分析法檢測(cè)不同濃度IGF-1(2.5～100ng/ml)對(duì)人毛乳頭細(xì)胞增殖的影響。 5 MTT比色分析法檢測(cè)不同濃度復(fù)方甘草酸苷(0.5～100μg/ml)對(duì)人毛乳頭細(xì)胞增殖的影響。 6 MTT比色分析法檢測(cè)不同濃度地塞米松(0.5～100μg/ml)對(duì)人毛乳頭細(xì)胞增殖的影響。 7運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析,以α=0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果: 1人毛乳頭細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 1.1人毛乳頭細(xì)胞的分離、培養(yǎng) 經(jīng)“二步酶消化法”得到的毛乳頭,在倒置顯微鏡下觀察呈圓形或橢圓形,第二天即可見貼壁,貼壁1天后可觀察到細(xì)胞遷出,向四周呈放射狀生長。2～3周后細(xì)胞大部分生長融合,低倍鏡下可見細(xì)胞呈漩渦狀生長,有多層凝集趨勢(shì),細(xì)胞呈長梭形。細(xì)胞消化傳代后第2天可見細(xì)胞貼壁展開,隨著細(xì)胞數(shù)目增多,又融合形成多層凝集性生長。細(xì)胞傳代后增殖速度也加快,尤以3～5代細(xì)胞最為顯著,且均可見凝集性生長。隨毛乳頭細(xì)胞傳代次數(shù)增加,凝集性逐漸消失,細(xì)胞變?yōu)槎鄻O、梭形或細(xì)長的成纖維細(xì)胞樣,生長速度變慢,傳代周期明顯延長。 1.2人毛乳頭細(xì)胞的鑒定 人毛乳頭細(xì)胞α-SMA免疫組化染色呈陽性。 2免疫組織化學(xué)S-p法分別檢測(cè)3代、9代細(xì)胞IGF-1和FGF7的表達(dá) IGF-1與FGF7均表達(dá)于細(xì)胞胞漿,著色由黃色到褐色不等。3代和9代毛乳頭細(xì)胞免疫組化染色后IGF-1表達(dá)分別為+～++和+;FGF7表達(dá)分別為+～++和±～+。 3流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)3代、9代毛乳頭細(xì)胞IGF-1、FGF7的表達(dá) 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,3代、9代毛乳頭細(xì)胞IGF-1的均道值分別為270.98±26.84、232.14±14.80,前者大于后者,但統(tǒng)計(jì)分析表明兩者相比無顯著性差異(P0.05)。3代、9代毛乳頭細(xì)胞FGF7的均道值分別為373.51±24.97、270.91±32.83,前者大于后者,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明兩者有顯著性差異(P0.05)。 4流式細(xì)胞儀檢測(cè)人毛乳頭細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期分布 3代和9代毛乳頭細(xì)胞處于G1期的細(xì)胞比率分別為55.53±3.34%、57.53±6.84%;處于S期的細(xì)胞比率分別為34.87±3.18%、34.10±6.36%;處于G2期的細(xì)胞比率分別為7.82±3.37%、8.40±3.19%。各期細(xì)胞兩者比較均無明顯差異(P0.05)。兩組細(xì)胞的凋亡率分別為1.36±0.24%、1.28±0.63%,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 5 IGF-1對(duì)人毛乳頭細(xì)胞增殖的影響 處于對(duì)數(shù)生長期的第4代毛乳頭細(xì)胞加入不同濃度的重組人IGF-1培養(yǎng)72h后,MTT結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,各濃度組均有明顯促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞增殖的作用(P0.05),其中以2.5ng/ml最為顯著,其余各組間無明顯差異,濃度再增加,促增殖作用并不增強(qiáng)。 6復(fù)方甘草酸苷對(duì)人毛乳頭細(xì)胞增殖的影響 處于對(duì)數(shù)生長期的第4代毛乳頭細(xì)胞加入不同濃度的復(fù)方甘草酸苷培養(yǎng)72h后,MTT結(jié)果顯示在0.5～20μg/ml濃度內(nèi),促增殖作用呈劑量依賴性,以20μg/ml組刺激作用最強(qiáng),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),濃度再增加,其促增殖作用反而減弱。 7地塞米松對(duì)人毛乳頭細(xì)胞增殖的影響 在處于對(duì)數(shù)生長期的第4代毛乳頭細(xì)胞中加入不同濃度的地塞米松培養(yǎng)72h后,MTT結(jié)果顯示在0.5～2.5μg/ml濃度內(nèi),促增殖作用呈劑量依賴性,以2.5μg/ml組刺激作用最強(qiáng),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),濃度再增加,其促增殖作用有所減弱。 結(jié)論: 1二步酶消化法可簡便、快捷、有效地分離獲得毛乳頭。體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞在6代之前呈明顯的凝集性生長特性,繼續(xù)傳代該特性逐漸消失。 2凝集性與非凝集性生長的毛乳頭細(xì)胞各細(xì)胞周期與凋亡均無明顯差異,表明體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞維持在比較穩(wěn)定的增殖狀態(tài)。 3 FGF7在凝集性生長的毛乳頭細(xì)胞中表達(dá)明顯高于非凝集性生長的毛乳頭細(xì)胞,推測(cè)凝集性生長的毛乳頭細(xì)胞促進(jìn)毛母質(zhì)細(xì)胞增殖角化可能與FGF7有關(guān)。 4 IGF-1可明顯刺激毛乳頭細(xì)胞增殖,同時(shí)受毛乳頭細(xì)胞表面的IGF結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)。IGF-1在凝集性生長的毛乳頭細(xì)胞中表達(dá)高于非凝集性生長的毛乳頭細(xì)胞,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,IGF-1促進(jìn)毛囊生長的機(jī)制有待進(jìn)一步探討。 5復(fù)方甘草酸苷和地塞米松在抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抑制的同時(shí)還可能通過調(diào)節(jié)毛乳頭細(xì)胞的活性,誘導(dǎo)毛發(fā)生長。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R751

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本文編號(hào)：2538184