發(fā)布時間：2019-08-14 17:32

【摘要】：研究背景 腫瘤細胞有別于正常細胞的主要特性是生命力強、無限增殖、無接觸抑制性并且具有局部浸潤和遷移遠端的能力,特別是惡性腫瘤的侵襲特性,其對遠端組織器官的侵襲破壞往往是惡性腫瘤導(dǎo)致患者死亡的關(guān)鍵原因。常規(guī)的腫瘤治療策略對控制原位腫瘤的增殖生長能夠起到一定的作用,但是對腫瘤細胞遷移侵襲能力的抑制任然十分有限。腫瘤轉(zhuǎn)移是多種轉(zhuǎn)移相關(guān)因子共同作用的結(jié)果,惡性瘤細胞轉(zhuǎn)移早期的重要事件就是對細胞外基質(zhì)(extra cellular matrix, ECM)的降解,基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)可以水解不同類型的膠原蛋白、纖粘連蛋白、層粘連蛋白,在ECM降解,瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。MMP-9是MMP家族的主要成員,也稱為明膠酶B,水解基底膜中的Ⅳ型膠原,刺激腫瘤細胞的生長、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移,甚至能通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)來調(diào)節(jié)腫瘤血管生成。 惡性黑色素瘤(malignant melanoma, MM)是免疫原性最強的腫瘤之一,是研究免疫治療、基因治療的首選腫瘤模型。第一例惡性腫瘤的基因治療就針對于晚期黑色素瘤。Rosenberg小組將腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)基因經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在體外轉(zhuǎn)染來進行晚期黑色素瘤的治療。RNA干擾(RNAinterference, RNAi)是有效雙鏈RNA引起的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)現(xiàn)象,為抑制mRNA分子合成蛋白提供了快速而相對簡便的途徑。伴隨RNAi技術(shù)的完善,RNAi技術(shù)已經(jīng)運用于腫瘤的基因治療。因此,本研究使用RNAi技術(shù)靶向沉默小鼠黑色素瘤B16細胞中的MMP-9,理論上具有抑制腫瘤增殖轉(zhuǎn)移的可行性。 研究目的 1.篩選B16細胞MMP-9基因干擾序列； 2.探究體外干擾MMP-9對B16小鼠黑色素瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響； 3.體內(nèi)研究干擾MMP-9對C57BL/6小鼠惡性黑色素瘤侵襲轉(zhuǎn)移的影響。 研究方法 1.針對小鼠MMP-9尋找干擾靶位點,針對靶位點設(shè)計shRNA干擾序列,用pGensil-1質(zhì)粒為基本質(zhì)粒結(jié)構(gòu),在其U6 Promoter和CMV Promoter之間插入針對MMP-9的不同RNA干擾序列,構(gòu)建干擾載體。使用陽離子復(fù)合物轉(zhuǎn)染試劑將干擾載體轉(zhuǎn)染進入B16細胞,流式細胞技術(shù)測定轉(zhuǎn)染效率,激光共聚焦顯微鏡觀察細胞形態(tài)及熒光表達情況,實時熒光定量PCR方法檢測每種載體的干擾效果,優(yōu)選干擾載體； 2.使用優(yōu)選的MMP-9干擾載體在體外水平干擾B16細胞的MMP-9,Western blotting實驗檢測細胞表達MMP-9蛋白變化,Transwell實驗檢測干擾MMP-9后B16細胞遷移能力、侵襲能力的變化； 3.以小鼠爪墊皮下移植法建立C57小鼠黑色素瘤侵襲模型,繼而采用局部瘤體注射針對MMP-9基因的RNA干擾復(fù)合物給予病鼠基因治療,評估治療效果。 研究結(jié)果 1.構(gòu)建了p-9-RNAi-1#,2#,3#三種干擾載體。在轉(zhuǎn)染效率保證的基礎(chǔ)上,定量PCR檢測表明2#載體在24h到48h整個過程中表現(xiàn)出持續(xù)的干擾效力并呈現(xiàn)出上升趨勢,從32%到達63%,是三者中最優(yōu)干擾載體； 2.RNAi沉默MMP-9后,實驗組與對照組MMP-9蛋白質(zhì)水平?jīng)]有檢測到明顯的差異性,但是體外遷移侵襲中干擾組的遷移侵襲能力明顯下降； 3.對小鼠足墊模型原位瘤給予局部瘤體注射MMP-9干擾質(zhì)粒后腫瘤轉(zhuǎn)移受到抑制。 研究結(jié)論 實驗表明2#載體是最為有效的干擾載體,可以在體外水平有力下調(diào)小鼠黑色素瘤B16細胞MMP-9的mRNA表達,抑制細胞的遷移力、侵襲力；在體內(nèi)水平可以對腫瘤的生長起到明顯抑制作用。
【圖文】：

流式細胞儀測定各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率

質(zhì)粒純度比值略高，，可能是由于離J自柱型試劑盒的方法有差異，但是后續(xù)的瓊脂糖電泳檢測可看到每個樣本的RNA完整度良好。24h檢測點個樣本R〔NA見圖5。48h和24h電泳情況一致。后續(xù)每組取2抖gRNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R739.5

【參考文獻】

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1 梁水權(quán);呂益中;王羲中;王育烽;;FAK和MMP-9蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達及相關(guān)性研究[J];結(jié)直腸肛門外科;2008年03期

2 葛夕洪;楊晶;徐銳;王永利;司同國;賀能樹;;MMP-2、MMP-9、TIMP-1在血管成形術(shù)后再狹窄中的表達及其意義的實驗研究[J];中國介入影像與治療學(xué);2008年03期

3 任志偉;俞永林;楊豐建;喬健;姜建元;肖保國;王靜;;IL-1β對兔關(guān)節(jié)軟骨細胞MMP-1/-13mRNA表達和NO的影響[J];復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2008年02期

本文編號：2526701