【摘要】：研究背景 腫瘤細(xì)胞有別于正常細(xì)胞的主要特性是生命力強(qiáng)、無(wú)限增殖、無(wú)接觸抑制性并且具有局部浸潤(rùn)和遷移遠(yuǎn)端的能力,特別是惡性腫瘤的侵襲特性,其對(duì)遠(yuǎn)端組織器官的侵襲破壞往往是惡性腫瘤導(dǎo)致患者死亡的關(guān)鍵原因。常規(guī)的腫瘤治療策略對(duì)控制原位腫瘤的增殖生長(zhǎng)能夠起到一定的作用,但是對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移侵襲能力的抑制任然十分有限。腫瘤轉(zhuǎn)移是多種轉(zhuǎn)移相關(guān)因子共同作用的結(jié)果,惡性瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移早期的重要事件就是對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix, ECM)的降解,基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)可以水解不同類型的膠原蛋白、纖粘連蛋白、層粘連蛋白,在ECM降解,瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。MMP-9是MMP家族的主要成員,也稱為明膠酶B,水解基底膜中的Ⅳ型膠原,刺激腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移,甚至能通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤血管生成。 惡性黑色素瘤(malignant melanoma, MM)是免疫原性最強(qiáng)的腫瘤之一,是研究免疫治療、基因治療的首選腫瘤模型。第一例惡性腫瘤的基因治療就針對(duì)于晚期黑色素瘤。Rosenberg小組將腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)基因經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在體外轉(zhuǎn)染來(lái)進(jìn)行晚期黑色素瘤的治療。RNA干擾(RNAinterference, RNAi)是有效雙鏈RNA引起的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)現(xiàn)象,為抑制mRNA分子合成蛋白提供了快速而相對(duì)簡(jiǎn)便的途徑。伴隨RNAi技術(shù)的完善,RNAi技術(shù)已經(jīng)運(yùn)用于腫瘤的基因治療。因此,本研究使用RNAi技術(shù)靶向沉默小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞中的MMP-9,理論上具有抑制腫瘤增殖轉(zhuǎn)移的可行性。 研究目的 1.篩選B16細(xì)胞MMP-9基因干擾序列； 2.探究體外干擾MMP-9對(duì)B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響； 3.體內(nèi)研究干擾MMP-9對(duì)C57BL/6小鼠惡性黑色素瘤侵襲轉(zhuǎn)移的影響。 研究方法 1.針對(duì)小鼠MMP-9尋找干擾靶位點(diǎn),針對(duì)靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)shRNA干擾序列,用pGensil-1質(zhì)粒為基本質(zhì)粒結(jié)構(gòu),在其U6 Promoter和CMV Promoter之間插入針對(duì)MMP-9的不同RNA干擾序列,構(gòu)建干擾載體。使用陽(yáng)離子復(fù)合物轉(zhuǎn)染試劑將干擾載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入B16細(xì)胞,流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定轉(zhuǎn)染效率,激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及熒光表達(dá)情況,實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)每種載體的干擾效果,優(yōu)選干擾載體； 2.使用優(yōu)選的MMP-9干擾載體在體外水平干擾B16細(xì)胞的MMP-9,Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)MMP-9蛋白變化,Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾MMP-9后B16細(xì)胞遷移能力、侵襲能力的變化； 3.以小鼠爪墊皮下移植法建立C57小鼠黑色素瘤侵襲模型,繼而采用局部瘤體注射針對(duì)MMP-9基因的RNA干擾復(fù)合物給予病鼠基因治療,評(píng)估治療效果。 研究結(jié)果 1.構(gòu)建了p-9-RNAi-1#,2#,3#三種干擾載體。在轉(zhuǎn)染效率保證的基礎(chǔ)上,定量PCR檢測(cè)表明2#載體在24h到48h整個(gè)過(guò)程中表現(xiàn)出持續(xù)的干擾效力并呈現(xiàn)出上升趨勢(shì),從32%到達(dá)63%,是三者中最優(yōu)干擾載體； 2.RNAi沉默MMP-9后,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組MMP-9蛋白質(zhì)水平?jīng)]有檢測(cè)到明顯的差異性,但是體外遷移侵襲中干擾組的遷移侵襲能力明顯下降； 3.對(duì)小鼠足墊模型原位瘤給予局部瘤體注射MMP-9干擾質(zhì)粒后腫瘤轉(zhuǎn)移受到抑制。 研究結(jié)論 實(shí)驗(yàn)表明2#載體是最為有效的干擾載體,可以在體外水平有力下調(diào)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞MMP-9的mRNA表達(dá),抑制細(xì)胞的遷移力、侵襲力；在體內(nèi)水平可以對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)起到明顯抑制作用。
【圖文】：

流式細(xì)胞儀測(cè)定各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率

質(zhì)粒純度比值略高，，可能是由于離J自柱型試劑盒的方法有差異，但是后續(xù)的瓊脂糖電泳檢測(cè)可看到每個(gè)樣本的RNA完整度良好。24h檢測(cè)點(diǎn)個(gè)樣本R〔NA見(jiàn)圖5。48h和24h電泳情況一致。后續(xù)每組取2抖gRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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2 葛夕洪;楊晶;徐銳;王永利;司同國(guó);賀能樹(shù);;MMP-2、MMP-9、TIMP-1在血管成形術(shù)后再狹窄中的表達(dá)及其意義的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)介入影像與治療學(xué);2008年03期

3 任志偉;俞永林;楊豐建;喬健;姜建元;肖保國(guó);王靜;;IL-1β對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞MMP-1/-13mRNA表達(dá)和NO的影響[J];復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年02期

本文編號(hào)：2526701