【摘要】：[目的]維生素D受體(VDR)是一種核受體,在細(xì)胞核內(nèi)與配體1,25(OH)2D3結(jié)合后,結(jié)合于目標(biāo)基因的VDR反應(yīng)元件(VDRE),啟動(dòng)基因的表達(dá)。VDR缺陷的人和鼠均表現(xiàn)出表皮和毛囊生長發(fā)育的異常。本課題旨在研究VDR在調(diào)節(jié)鼠表皮和毛囊細(xì)胞增殖分化中的作用及機(jī)制,為臨床進(jìn)一步探索人類VDR相關(guān)性皮膚和毛發(fā)疾病的發(fā)病機(jī)理和新治療手段提供基礎(chǔ)。[方法]1.構(gòu)建VDR基因敲除鼠(VDR KO),觀察VDR基因功能性缺失對鼠表皮和毛囊生長發(fā)育的影響,并重新轉(zhuǎn)染人類VDR(hVDR)基因片段加以驗(yàn)證。用HE染色觀察VDR基因敲除和重新轉(zhuǎn)染hVDR后鼠表皮和毛囊的組織學(xué)改變,并用RT-PCR方法檢測皮膚中與細(xì)胞增殖分化有關(guān)的基因如FLG、LOR、K10、K14、Ki-67在VDR敲除前后表達(dá)的影響。在離體培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞中觀察WT與KO鼠細(xì)胞在體外增殖分化行為方面的差異,并通過制造皮膚傷口觀察傷口愈合過程中WT與KO鼠在愈合速度、細(xì)胞增殖層次、BrdU染色陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞分化指標(biāo)Involucrin表達(dá)上的差異。最后用免疫熒光法檢測WT與KO鼠中毛囊干細(xì)胞的定位特征,并用流式細(xì)胞法分選出生后18天的WT和KO鼠中CD34和CD49f雙標(biāo)陽性的毛囊干細(xì)胞,定量比較VDR基因敲除對鼠毛囊干細(xì)胞的影響。2.用拔毛法誘導(dǎo)鼠的毛囊生長期,用RT-PCR方法檢測拔毛前后WT與KO鼠中Shh和cWnt通路目標(biāo)基因包括Shh、Gli1、Ptc2,Msx2、wifl的表達(dá)變化。然后用Shh通路激動(dòng)劑(SAG)外用于鼠皮膚,觀察Shh通路激活對鼠皮膚組織中cWnt和Shh下游目標(biāo)基因表達(dá)的影響。最后用CHIP-RT-PCR方法檢測VDR與cWnt和Shh通路目標(biāo)基因DNA啟動(dòng)調(diào)節(jié)區(qū)的結(jié)合情況,以探討VDR如何參與調(diào)控cWnt和Shh通路間的交叉對話作用。3.用免疫熒光法檢測出生后不同年齡階段和毛囊周期中表皮和毛囊細(xì)胞中DDIT4的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況,然后用RT-PCR法檢測VDR基因敲除對鼠角質(zhì)形成細(xì)胞和毛囊干細(xì)胞中DDIT4的表達(dá)影響,并再轉(zhuǎn)染hVDR加以驗(yàn)證。檢測皮膚傷口愈合過程中,DDIT4在WT和KO鼠傷口周緣新生組織中的表達(dá)差異,觀察DDIT4在VDR基因敲除前后對皮膚傷口愈合的影響；然后用不同濃度的1,25(OH)2D3刺激離體培養(yǎng)的WT和KO鼠角質(zhì)形成細(xì)胞,觀察DDIT4的誘導(dǎo)表達(dá)與VDR配體1,25(OH)2D3之間是否具有濃度依賴性。最后用CHIP-RT-PCR法檢測VDR與DDIT4基因啟動(dòng)區(qū)的結(jié)合情況,以明確VDR如何參與DDIT4-cWnt-Shh通路之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)作用。[結(jié)果]1.在特異性敲除VDR BD區(qū)域第二個(gè)鋅指片段的氨基酸序列后,發(fā)現(xiàn)VDR的功能性喪失導(dǎo)致了KO鼠出現(xiàn)皮膚和毛囊發(fā)育的明顯異常,表現(xiàn)為表皮增殖過度、毛囊角化、毛發(fā)脫落伴表皮囊腫形成；在重新轉(zhuǎn)染hVDR后,這種現(xiàn)象得以糾正�；驒z測結(jié)果顯示,在KO鼠中,FLG、LOR、K10的基因表達(dá)明顯下調(diào),K14未見變化,而Ki-67基因表達(dá)上升。在皮膚傷口愈合中,KO鼠在術(shù)后中期的生長速度快于WT鼠,傷口邊緣新生的表皮細(xì)胞層數(shù)及BrdU染色陽性細(xì)胞數(shù)也明顯增多,但反應(yīng)細(xì)胞分化的指標(biāo)Involucrin則低于WT組。流式細(xì)胞術(shù)分選結(jié)果顯示,出生后18天的KO鼠中CD34和CD49f雙標(biāo)陽性的毛囊干細(xì)胞數(shù)目顯著低于WT,表明KO鼠在出生后毛囊形態(tài)發(fā)生周期完成后即出現(xiàn)毛囊干細(xì)胞的進(jìn)行性減少。2. VDR KO鼠存在由拔毛法誘導(dǎo)的生長期形成障礙,表現(xiàn)為在拔毛后無毛發(fā)再生。基因檢測結(jié)果顯示,在拔毛后KO鼠中cWnt和Shh通路反應(yīng)出現(xiàn)異常,表現(xiàn)為Shh通路的相關(guān)基因如Shh、Gli1、Ptc2,以及cWnt通路的相關(guān)基因Msx2和wif1不能被誘導(dǎo)表達(dá)。給予SAG刺激毛發(fā)生長后,16天和7周齡KO鼠對SAG的刺激無反應(yīng),而WT有明顯新發(fā)生成。SAG刺激后WT鼠中Wif1、Gli1、Shh、Ptc2的基因表達(dá)上調(diào),有較多BrdU染色陽性的毛囊角質(zhì)形成細(xì)胞生成,而KO鼠的毛囊僅見到少數(shù)處于增殖狀態(tài)的BrdU陽性細(xì)胞。進(jìn)一步的CHIP-RT-PCR分析表明,VDR明顯地富集在WT鼠的Shh下游基因Gli1和cWnt下游基因Axin2、cMYC,以及OC基因的啟動(dòng)調(diào)節(jié)區(qū)；但KO鼠卻沒有類似的結(jié)合現(xiàn)象,提示VDR通過與cWnt、Shh目標(biāo)基因的啟動(dòng)區(qū)相結(jié)合而參與二者基因的表達(dá)調(diào)控。3. DDIT4動(dòng)態(tài)地參與了鼠表皮生長和毛囊周期循環(huán)過程。在WT鼠第一個(gè)退行期,隨著毛囊細(xì)胞的增殖和蛋白合成能力下降,DDIT4出現(xiàn)高表達(dá)；在轉(zhuǎn)入生長期后表達(dá)降低；再次進(jìn)入休止期后表達(dá)又重新上調(diào)。而在KO鼠,由于VDR的敲除,DDIT4失去這種動(dòng)態(tài)變化特征。RT-PCR和Western blot結(jié)果也證實(shí),在體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞中DDIT4在KO中的表達(dá)量低于WT,在轉(zhuǎn)染hVDR后上升。在經(jīng)流式篩選的毛囊干細(xì)胞中WT鼠DDIT4表達(dá)卻低于KO。且VDR在表皮細(xì)胞中對DDIT4的表達(dá)調(diào)控具有配體影響性,受1,25(OH)2D3的正向促進(jìn)。在皮膚傷口愈合中,DDIT4在傷后中期主要表達(dá)于WT鼠的基底層,強(qiáng)度高于KO鼠,這也與第一部分實(shí)驗(yàn)中觀察到的傷后中期KO鼠的表皮細(xì)胞增殖快于WT相符。CHIP-RT-PCR分析顯示,VDR與DDIT4 DNA啟動(dòng)區(qū)有明顯結(jié)合,其中以-963～-1154bp處的結(jié)合能力最強(qiáng),并且也受1,25(OH)2D3的正向促進(jìn),表明VDR可通過與DDIT4啟動(dòng)區(qū)的基因調(diào)節(jié)序列相結(jié)合而調(diào)控其表達(dá),參與了鼠的表皮和毛囊分化發(fā)育過程。[結(jié)論]1.VDR參與了調(diào)控鼠表皮和毛囊的生長發(fā)育。在VDR基因敲除后,KO鼠出現(xiàn)表皮過度增殖、皮內(nèi)囊腫形成和毛發(fā)脫失,并且是一種非配體和鈣磷代謝依賴的行為,其原因可能與VDR基因敲除導(dǎo)致了多種細(xì)胞增殖分化有關(guān)基因的表達(dá)障礙有關(guān),而且KO鼠的毛囊干細(xì)胞在出生后18天即開始出現(xiàn)減少。2.在角質(zhì)形成細(xì)胞中,VDR通過與cWnt和Shh通路目標(biāo)基因的DNA啟動(dòng)調(diào)節(jié)區(qū)相結(jié)合,而啟動(dòng)對通路的表達(dá)調(diào)控,從而形成了VDR-cWnt-Shh通路之間的交叉對話,共同調(diào)控表皮和毛囊細(xì)胞的增殖分化。3. DDIT4參與了鼠表皮發(fā)育和毛囊周期的動(dòng)態(tài)循環(huán)過程。DDIT4在Bugle處的持續(xù)高表達(dá)可能與干細(xì)胞的功能狀態(tài)維護(hù)有關(guān),且KO鼠毛囊干細(xì)胞內(nèi)的DDIT4表達(dá)較WT高,這可能參與了對出生后KO鼠毛囊干細(xì)胞的功能抑制。VDR可結(jié)合于DDIT4 DNA啟動(dòng)區(qū)-963--1154bp位置而調(diào)控DDIT4的表達(dá),并受1,25(OH)2D3的正向促進(jìn)。由于cWnt、Shh處于DDIT4的下游,因而它們之間可能進(jìn)一步形成了VDR-DDIT4-cWnt-Shh的更大作用網(wǎng)絡(luò),從而共同參與VDR在鼠表皮和毛囊發(fā)育的調(diào)控作用。
文內(nèi)圖片：
圖片說明： 物能夠依賴ＤＢＤ區(qū)Ｗ識(shí)別ＤＮＡ上的ＶＤＲＥ序列，，從而在共激活子、轉(zhuǎn)錄因子１舊逡逑（ＴＦ贓）、ＴＴＩＩＤ及ＲＮＡ聚合酶的共同作用下，形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，啟動(dòng)多種基因逡逑的表達(dá)（圖２）。逡逑１６逡逑
文內(nèi)圖片：
圖片說明： ｄｌ邋ｄ２邋扣邋ｄ５邐ｄｌ邋ｄ２邋ｄ３邋ｄ５逡逑圖２．３提毛法對ＷＴ和ＫＯ鼠皮膚ｃＷｎｔ和Ｓｈｈ信號通路基因表達(dá)的巧喻逡逑Ｆｉｇ．邋２．３邋Ｇｅｎｅｓ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｃＷｎｔ邋ａｎｄ邋Ｓｈｈ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙｓ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ｄｅｐｉｌａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ＷＴ逡逑ａｎｄ邋ＫＯ邋ｍｉｃｅ逡逑３邋Ｓｈｈ邋ａｇｏｎ邋ｉ邋Ｓｔ邋（ＳＡＧ）對ＷＴ和ＫＯ鼠毛發(fā)生長的誘導(dǎo)效應(yīng)逡逑ＳＡＧ為Ｓｍｏ受體的激動(dòng)劑，可激活Ｓｈｈ信號通路而啟動(dòng)下游相關(guān)基因的表達(dá)。逡逑為進(jìn)一步研究Ｓｈｈ通路與ＶＤ民之間的相互作用，實(shí)驗(yàn)將ＳＡＧ外涂于ＷＴ和ＫＯ逡逑鼠的皮膚，觀察對鼠毛發(fā)生長和基因表達(dá)的影響。因出生后１６ｄ是鼠第一個(gè)毛囊逡逑休止期的開始點(diǎn)，而首先選用出生后１６ｄ的ＷＴ和ＫＯ鼠進(jìn)行處理，在連續(xù)給藥６逡逑天后，檢測毛發(fā)生長和基因表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ＳＡＧ誘導(dǎo)了邋ＷＴ鼠皮膚組織中逡逑Ｗｉｆｉ、Ｇｌｉｌ、Ｓｈｈ、Ｐｔｃ２基因表達(dá)的上調(diào)，但對ＫＯ鼠無明顯影響（圖２．４）。逡逑５９逡逑
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R751

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本文編號：2515484