發(fā)布時間：2019-06-27 15:18

【摘要】：背景:黑素瘤是起源于皮膚黑素細胞的惡性腫瘤,其發(fā)展迅速,不易治療。雖然針對基因突變或腫瘤免疫的分子靶向治療為黑素瘤患者提供了新的治療手段,但隨之而來的副作用及耐藥現(xiàn)象嚴重降低了其治療效率及臨床應用。這一結果提示:黑素瘤發(fā)生發(fā)展過程中存在其他調(diào)控機制,針對未知機制的探討將有助于從根本上提升黑素瘤的診療水平。自噬是細胞內(nèi)重要的生理過程,通過降解變性、受損以及失去功能的細胞器及蛋白等成分維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)并在應激條件下為細胞提供必要的能量供給。近年來大量研究表明,自噬是維持腫瘤生長的重要供能方式,在黑素瘤中具有早期抑制腫瘤發(fā)生而晚期促進腫瘤進展的雙重作用,然而介導這一雙重作用的上游調(diào)控機制尚未完全闡明。SIRT6作為Sirtuins家族成員,在DNA修復、基因表達調(diào)控、衰老及抑制炎癥等過程中發(fā)揮重要作用。目前被認為是細胞內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)控者,可通過生長因子介導的多個網(wǎng)絡調(diào)控機制影響代謝,是腫瘤能量代謝的關鍵調(diào)控分子。研究表明,SIRT6介導的自噬水平變化在氧化應激誘導的神經(jīng)細胞凋亡損傷及吸煙引起的支氣管上皮細胞衰老中,發(fā)揮促進損傷和抑制衰老的雙向作用。這一現(xiàn)象提示:SIRT6可能是黑素瘤中導致自噬差異表達的原因之一。然而,上述研究均集中于衰老、炎癥等非腫瘤疾病中,腫瘤中尤其黑素瘤中SIRT6對自噬的調(diào)控及其作用機制尚不明確。針對這一問題的深入研究有助于深化SIRT6對自噬調(diào)控的認識,拓展二者參與調(diào)控的疾病譜。并為黑素瘤的臨床診療提供新的思路及治療靶點,對黑素瘤臨床選擇用藥具有重要意義�；谝陨涎芯堪l(fā)現(xiàn),我們提出以下科學假說:在不同分期黑素瘤中,SIRT6可通過調(diào)控細胞內(nèi)自噬水平發(fā)揮抑制早期黑素瘤生長而促進晚期黑素瘤生長的雙重作用。目的:1.檢測并驗證黑素瘤中SIRT6與細胞自噬水平的表達及其相關性分析;2.明確黑素瘤中SIRT6對細胞自噬的調(diào)控作用及其功能;3.闡明SIRT6調(diào)控細胞自噬參與黑素瘤細胞生長的分子機制。方法:1.利用qRT-PCR、Western blot及免疫熒光技術從組織、細胞系水平對SIRT6mRNA、蛋白水平及定位進行檢測;同時,利用Western blot、免疫熒光技術對自噬相關分子LC3、SQSTM1/p62蛋白表達進行檢測;利用相關性分析對SIRT6及自噬相關分子的蛋白表達灰度值進行統(tǒng)計分析;明確二者的相關性;2.利用基因干擾技術,過表達/干涉SIRT6,應用CCK8檢測SIRT6對黑素瘤細胞生長活性的影響;利用流式細胞術檢測其對細胞生長周期的影響;利用western blot、流式技術檢測SIRT6對黑素瘤細胞凋亡的影響;3.分別利用基因干擾技術過表達/干涉自噬相關基因ATG5或自噬調(diào)節(jié)劑刺激細胞,應用CCK8檢測自噬對黑素瘤細胞生長活性的影響;利用流式細胞術檢測其對細胞生長周期的影響;利用western blot、流式技術檢測對黑素瘤細胞凋亡的影響;4.過表達/干涉SIRT6,聯(lián)合應用自噬激動劑雷帕霉素或抑制劑氯喹,利用western blot、電鏡、免疫熒光技術檢測干預SIRT6對黑素瘤細胞自噬水平的影響;5.過表達/干涉SIRT6,聯(lián)合應用自噬激動劑雷帕霉素或抑制劑氯喹,應用CCK8檢測SIRT6調(diào)控細胞自噬對黑素瘤細胞生長活性的影響;利用流式細胞術檢測其對細胞生長周期的影響;利用western blot、流式技術檢測SIRT6調(diào)控細胞自噬對黑素瘤細胞凋亡的影響;6.利用qRT-PCR、Western blot技術從組織、細胞系水平對IGF1R mRNA、蛋白水平進行檢測;同時,利用Western blot技術對IGF-Akt信號通路相關分子蛋白水平進行檢測;利用相關性分析對SIRT6及通路關鍵分子p-IGF1R、p-Akt473的蛋白表達灰度值進行統(tǒng)計分析;明確二者的相關性;7.過表達/干涉SIRT6,聯(lián)合過表達Akt或應用Akt1/2激酶抑制劑,利用western blot技術檢測干預SIRT6對IGF-Akt信號通路相關分子活化的影響;8.過表達Akt或應用Akt1/2激酶抑制劑,聯(lián)合過表達/干涉SIRT6,利用western blot技術檢測干預IGF-Akt信號通路對SIRT6調(diào)控自噬的影響;9.過表達Akt或應用Akt1/2激酶抑制劑,聯(lián)合過表達/干涉SIRT6,利用CCK8檢測IGF-Akt信號通路對黑素瘤細胞生長活性的影響;利用流式細胞術檢測其對細胞生長周期的影響;利用流式技術檢測IGF-Akt信號通路對黑素瘤細胞凋亡的影響;10.過表達/干涉SIRT6,利用裸鼠荷瘤模型檢測SIRT6對黑素瘤細胞生長的影響;利用Western blot技術檢測成瘤體內(nèi)SIRT6對IGF-Akt信號通路及自噬的影響;利用統(tǒng)計分析及組織病理學技術檢測裸鼠荷瘤模型臟器轉移能力。結果:1.與色素痣及原代黑素細胞相比,原發(fā)黑素瘤組織及細胞系中SIRT6及自噬表達水平均降低,而轉移黑素瘤組織及細胞系中SIRT6及自噬表達水平均升高,且二者呈線性正相關;選取SIRT6低表達及高表達的WM35、WM793B、A2058、A375四株細胞系為研究對象進行后續(xù)實驗;2.CCK8結果顯示:干預SIRT6表達可抑制不同分期黑素瘤細胞生長活性;細胞周期結果顯示:干預SIRT6表達可使不同分期黑素瘤細胞發(fā)生G1期阻滯;Western blot及流式結果顯示:干預SIRT6表達可促進不同分期黑素瘤細胞促凋亡蛋白的表達及細胞凋亡的發(fā)生;3.CCK8結果顯示:干預ATG5表達或應用自噬調(diào)節(jié)劑可抑制不同分期黑素瘤細胞生長活性;細胞周期結果顯示:干預ATG5表達或應用自噬調(diào)節(jié)劑可使不同分期黑素瘤細胞發(fā)生G1期阻滯;Western blot及流式結果顯示:干預ATG5表達或應用自噬調(diào)節(jié)劑可促進不同分期黑素瘤細胞促凋亡蛋白的表達及細胞凋亡的發(fā)生;4.Western blot、電鏡、免疫熒光結果顯示:SIRT6可正向調(diào)控黑素瘤細胞內(nèi)自噬水平;5.CCK8結果顯示:干預SIRT6表達聯(lián)合應用自噬調(diào)節(jié)劑后,可部分回復SIRT6對于不同分期黑素瘤細胞生長活性的抑制;細胞周期結果顯示:干預SIRT6表達聯(lián)合應用自噬調(diào)節(jié)劑后,可部分回復SIRT6對于不同分期黑素瘤細胞G1期阻滯的影響;流式結果顯示:干預SIRT6表達聯(lián)合應用自噬調(diào)節(jié)劑后,可部分回復SIRT6對不同分期黑素瘤細胞凋亡的促進作用;6.與色素痣及原代黑素細胞相比,原發(fā)黑素瘤組織及細胞系中IGF-Akt信號通路活化水平均升高,而轉移黑素瘤組織及細胞系中表達水平均降低,SIRT6與IGF-Akt信號通路二者之間呈線性負相關;7.Western blot結果顯示:干預SIRT6表達可負向調(diào)控IGF-Akt信號通路的活化;8.Western blot結果顯示:干預SIRT6表達聯(lián)合過表達Akt或抑制Akt活性后,SIRT6可通過負向調(diào)控IGF-Akt信號通路上調(diào)黑素瘤細胞內(nèi)的自噬水平;9.CCK8結果顯示:干預SIRT6表達聯(lián)合過表達Akt或抑制Akt活性后,可部分回復SIRT6對于不同分期黑素瘤細胞生長活性的抑制;細胞周期結果顯示:干預SIRT6表達聯(lián)合過表達Akt或抑制Akt活性后,可部分回復SIRT6對于不同分期黑素瘤細胞G1期阻滯的影響;流式結果顯示:干預SIRT6表達聯(lián)合過表達Akt或抑制Akt活性后,可部分回復SIRT6對不同分期黑素瘤細胞凋亡的促進作用;10.裸鼠荷瘤實驗顯示:SIRT6可減少原發(fā)黑素瘤瘤體的體積及重量,增加轉移黑素瘤瘤體的體積及重量;Western blot結果顯示:過表達SIRT6可抑制IGF-Akt信號通路,上調(diào)細胞自噬水平;干涉SIRT6可進一步活化IGF-Akt信號通路,抑制自噬水平。臟器轉移統(tǒng)計結果顯示:在SIRT6本底水平高表達的轉移黑素瘤細胞系中,較干涉SIRT6組,其肝臟轉移灶數(shù)目顯著增加;組織病理學檢查結果顯示:SIRT6本底水平高表達的轉移黑素瘤細胞系的裸鼠肝臟內(nèi)可見較多的異型細胞。結論:通過本課題的研究,我們首次發(fā)現(xiàn)黑素瘤中SIRT6在早期低表達而晚期高表達的雙向表達模式,并且其通過負向調(diào)控IGF-Akt信號通路介導黑素瘤細胞自噬水平的雙向表達,SIRT6可促進黑素瘤細胞自噬水平的升高。這一機制參與SIRT6調(diào)控黑素瘤細胞生長的過程。我們的發(fā)現(xiàn)加深了SIRT6對自噬調(diào)控的認識,拓展了二者參與調(diào)控的疾病譜。并為黑素瘤的臨床診療提供新的思路及治療靶點,對黑素瘤臨床選擇用藥具有重要意義。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.5
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本文編號：2506909