發(fā)布時(shí)間：2019-06-27 15:18

【摘要】：背景:黑素瘤是起源于皮膚黑素細(xì)胞的惡性腫瘤,其發(fā)展迅速,不易治療。雖然針對(duì)基因突變或腫瘤免疫的分子靶向治療為黑素瘤患者提供了新的治療手段,但隨之而來(lái)的副作用及耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重降低了其治療效率及臨床應(yīng)用。這一結(jié)果提示:黑素瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在其他調(diào)控機(jī)制,針對(duì)未知機(jī)制的探討將有助于從根本上提升黑素瘤的診療水平。自噬是細(xì)胞內(nèi)重要的生理過(guò)程,通過(guò)降解變性、受損以及失去功能的細(xì)胞器及蛋白等成分維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)并在應(yīng)激條件下為細(xì)胞提供必要的能量供給。近年來(lái)大量研究表明,自噬是維持腫瘤生長(zhǎng)的重要供能方式,在黑素瘤中具有早期抑制腫瘤發(fā)生而晚期促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的雙重作用,然而介導(dǎo)這一雙重作用的上游調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。SIRT6作為Sirtuins家族成員,在DNA修復(fù)、基因表達(dá)調(diào)控、衰老及抑制炎癥等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)控者,可通過(guò)生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的多個(gè)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制影響代謝,是腫瘤能量代謝的關(guān)鍵調(diào)控分子。研究表明,SIRT6介導(dǎo)的自噬水平變化在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡損傷及吸煙引起的支氣管上皮細(xì)胞衰老中,發(fā)揮促進(jìn)損傷和抑制衰老的雙向作用。這一現(xiàn)象提示:SIRT6可能是黑素瘤中導(dǎo)致自噬差異表達(dá)的原因之一。然而,上述研究均集中于衰老、炎癥等非腫瘤疾病中,腫瘤中尤其黑素瘤中SIRT6對(duì)自噬的調(diào)控及其作用機(jī)制尚不明確。針對(duì)這一問(wèn)題的深入研究有助于深化SIRT6對(duì)自噬調(diào)控的認(rèn)識(shí),拓展二者參與調(diào)控的疾病譜。并為黑素瘤的臨床診療提供新的思路及治療靶點(diǎn),對(duì)黑素瘤臨床選擇用藥具有重要意義�；谝陨涎芯堪l(fā)現(xiàn),我們提出以下科學(xué)假說(shuō):在不同分期黑素瘤中,SIRT6可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)自噬水平發(fā)揮抑制早期黑素瘤生長(zhǎng)而促進(jìn)晚期黑素瘤生長(zhǎng)的雙重作用。目的:1.檢測(cè)并驗(yàn)證黑素瘤中SIRT6與細(xì)胞自噬水平的表達(dá)及其相關(guān)性分析;2.明確黑素瘤中SIRT6對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)控作用及其功能;3.闡明SIRT6調(diào)控細(xì)胞自噬參與黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制。方法:1.利用qRT-PCR、Western blot及免疫熒光技術(shù)從組織、細(xì)胞系水平對(duì)SIRT6mRNA、蛋白水平及定位進(jìn)行檢測(cè);同時(shí),利用Western blot、免疫熒光技術(shù)對(duì)自噬相關(guān)分子LC3、SQSTM1/p62蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè);利用相關(guān)性分析對(duì)SIRT6及自噬相關(guān)分子的蛋白表達(dá)灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;明確二者的相關(guān)性;2.利用基因干擾技術(shù),過(guò)表達(dá)/干涉SIRT6,應(yīng)用CCK8檢測(cè)SIRT6對(duì)黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響;利用western blot、流式技術(shù)檢測(cè)SIRT6對(duì)黑素瘤細(xì)胞凋亡的影響;3.分別利用基因干擾技術(shù)過(guò)表達(dá)/干涉自噬相關(guān)基因ATG5或自噬調(diào)節(jié)劑刺激細(xì)胞,應(yīng)用CCK8檢測(cè)自噬對(duì)黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響;利用western blot、流式技術(shù)檢測(cè)對(duì)黑素瘤細(xì)胞凋亡的影響;4.過(guò)表達(dá)/干涉SIRT6,聯(lián)合應(yīng)用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素或抑制劑氯喹,利用western blot、電鏡、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)干預(yù)SIRT6對(duì)黑素瘤細(xì)胞自噬水平的影響;5.過(guò)表達(dá)/干涉SIRT6,聯(lián)合應(yīng)用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素或抑制劑氯喹,應(yīng)用CCK8檢測(cè)SIRT6調(diào)控細(xì)胞自噬對(duì)黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響;利用western blot、流式技術(shù)檢測(cè)SIRT6調(diào)控細(xì)胞自噬對(duì)黑素瘤細(xì)胞凋亡的影響;6.利用qRT-PCR、Western blot技術(shù)從組織、細(xì)胞系水平對(duì)IGF1R mRNA、蛋白水平進(jìn)行檢測(cè);同時(shí),利用Western blot技術(shù)對(duì)IGF-Akt信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白水平進(jìn)行檢測(cè);利用相關(guān)性分析對(duì)SIRT6及通路關(guān)鍵分子p-IGF1R、p-Akt473的蛋白表達(dá)灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;明確二者的相關(guān)性;7.過(guò)表達(dá)/干涉SIRT6,聯(lián)合過(guò)表達(dá)Akt或應(yīng)用Akt1/2激酶抑制劑,利用western blot技術(shù)檢測(cè)干預(yù)SIRT6對(duì)IGF-Akt信號(hào)通路相關(guān)分子活化的影響;8.過(guò)表達(dá)Akt或應(yīng)用Akt1/2激酶抑制劑,聯(lián)合過(guò)表達(dá)/干涉SIRT6,利用western blot技術(shù)檢測(cè)干預(yù)IGF-Akt信號(hào)通路對(duì)SIRT6調(diào)控自噬的影響;9.過(guò)表達(dá)Akt或應(yīng)用Akt1/2激酶抑制劑,聯(lián)合過(guò)表達(dá)/干涉SIRT6,利用CCK8檢測(cè)IGF-Akt信號(hào)通路對(duì)黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響;利用流式技術(shù)檢測(cè)IGF-Akt信號(hào)通路對(duì)黑素瘤細(xì)胞凋亡的影響;10.過(guò)表達(dá)/干涉SIRT6,利用裸鼠荷瘤模型檢測(cè)SIRT6對(duì)黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響;利用Western blot技術(shù)檢測(cè)成瘤體內(nèi)SIRT6對(duì)IGF-Akt信號(hào)通路及自噬的影響;利用統(tǒng)計(jì)分析及組織病理學(xué)技術(shù)檢測(cè)裸鼠荷瘤模型臟器轉(zhuǎn)移能力。結(jié)果:1.與色素痣及原代黑素細(xì)胞相比,原發(fā)黑素瘤組織及細(xì)胞系中SIRT6及自噬表達(dá)水平均降低,而轉(zhuǎn)移黑素瘤組織及細(xì)胞系中SIRT6及自噬表達(dá)水平均升高,且二者呈線性正相關(guān);選取SIRT6低表達(dá)及高表達(dá)的WM35、WM793B、A2058、A375四株細(xì)胞系為研究對(duì)象進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);2.CCK8結(jié)果顯示:干預(yù)SIRT6表達(dá)可抑制不同分期黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性;細(xì)胞周期結(jié)果顯示:干預(yù)SIRT6表達(dá)可使不同分期黑素瘤細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯;Western blot及流式結(jié)果顯示:干預(yù)SIRT6表達(dá)可促進(jìn)不同分期黑素瘤細(xì)胞促凋亡蛋白的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的發(fā)生;3.CCK8結(jié)果顯示:干預(yù)ATG5表達(dá)或應(yīng)用自噬調(diào)節(jié)劑可抑制不同分期黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性;細(xì)胞周期結(jié)果顯示:干預(yù)ATG5表達(dá)或應(yīng)用自噬調(diào)節(jié)劑可使不同分期黑素瘤細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯;Western blot及流式結(jié)果顯示:干預(yù)ATG5表達(dá)或應(yīng)用自噬調(diào)節(jié)劑可促進(jìn)不同分期黑素瘤細(xì)胞促凋亡蛋白的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的發(fā)生;4.Western blot、電鏡、免疫熒光結(jié)果顯示:SIRT6可正向調(diào)控黑素瘤細(xì)胞內(nèi)自噬水平;5.CCK8結(jié)果顯示:干預(yù)SIRT6表達(dá)聯(lián)合應(yīng)用自噬調(diào)節(jié)劑后,可部分回復(fù)SIRT6對(duì)于不同分期黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性的抑制;細(xì)胞周期結(jié)果顯示:干預(yù)SIRT6表達(dá)聯(lián)合應(yīng)用自噬調(diào)節(jié)劑后,可部分回復(fù)SIRT6對(duì)于不同分期黑素瘤細(xì)胞G1期阻滯的影響;流式結(jié)果顯示:干預(yù)SIRT6表達(dá)聯(lián)合應(yīng)用自噬調(diào)節(jié)劑后,可部分回復(fù)SIRT6對(duì)不同分期黑素瘤細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用;6.與色素痣及原代黑素細(xì)胞相比,原發(fā)黑素瘤組織及細(xì)胞系中IGF-Akt信號(hào)通路活化水平均升高,而轉(zhuǎn)移黑素瘤組織及細(xì)胞系中表達(dá)水平均降低,SIRT6與IGF-Akt信號(hào)通路二者之間呈線性負(fù)相關(guān);7.Western blot結(jié)果顯示:干預(yù)SIRT6表達(dá)可負(fù)向調(diào)控IGF-Akt信號(hào)通路的活化;8.Western blot結(jié)果顯示:干預(yù)SIRT6表達(dá)聯(lián)合過(guò)表達(dá)Akt或抑制Akt活性后,SIRT6可通過(guò)負(fù)向調(diào)控IGF-Akt信號(hào)通路上調(diào)黑素瘤細(xì)胞內(nèi)的自噬水平;9.CCK8結(jié)果顯示:干預(yù)SIRT6表達(dá)聯(lián)合過(guò)表達(dá)Akt或抑制Akt活性后,可部分回復(fù)SIRT6對(duì)于不同分期黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性的抑制;細(xì)胞周期結(jié)果顯示:干預(yù)SIRT6表達(dá)聯(lián)合過(guò)表達(dá)Akt或抑制Akt活性后,可部分回復(fù)SIRT6對(duì)于不同分期黑素瘤細(xì)胞G1期阻滯的影響;流式結(jié)果顯示:干預(yù)SIRT6表達(dá)聯(lián)合過(guò)表達(dá)Akt或抑制Akt活性后,可部分回復(fù)SIRT6對(duì)不同分期黑素瘤細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用;10.裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)顯示:SIRT6可減少原發(fā)黑素瘤瘤體的體積及重量,增加轉(zhuǎn)移黑素瘤瘤體的體積及重量;Western blot結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)SIRT6可抑制IGF-Akt信號(hào)通路,上調(diào)細(xì)胞自噬水平;干涉SIRT6可進(jìn)一步活化IGF-Akt信號(hào)通路,抑制自噬水平。臟器轉(zhuǎn)移統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:在SIRT6本底水平高表達(dá)的轉(zhuǎn)移黑素瘤細(xì)胞系中,較干涉SIRT6組,其肝臟轉(zhuǎn)移灶數(shù)目顯著增加;組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示:SIRT6本底水平高表達(dá)的轉(zhuǎn)移黑素瘤細(xì)胞系的裸鼠肝臟內(nèi)可見(jiàn)較多的異型細(xì)胞。結(jié)論:通過(guò)本課題的研究,我們首次發(fā)現(xiàn)黑素瘤中SIRT6在早期低表達(dá)而晚期高表達(dá)的雙向表達(dá)模式,并且其通過(guò)負(fù)向調(diào)控IGF-Akt信號(hào)通路介導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞自噬水平的雙向表達(dá),SIRT6可促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞自噬水平的升高。這一機(jī)制參與SIRT6調(diào)控黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的過(guò)程。我們的發(fā)現(xiàn)加深了SIRT6對(duì)自噬調(diào)控的認(rèn)識(shí),拓展了二者參與調(diào)控的疾病譜。并為黑素瘤的臨床診療提供新的思路及治療靶點(diǎn),對(duì)黑素瘤臨床選擇用藥具有重要意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R739.5
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本文編號(hào)：2506909