【摘要】：隨著人類基因組計劃的完成,有關(guān)個體遺傳變異與疾病的關(guān)系日益受到重視,單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs )是人類基因組中遺傳學(xué)變異中最常見的一種類型,也是決定不同個體臨床表型多樣性的重要因素。因此對復(fù)雜性疾病進行SNPs研究對于臨床上早期診斷、預(yù)防和治療這類疾病有重要意義。 銀屑病(俗稱牛皮癬)是一種發(fā)病率高、易反復(fù)、治療困難的常見皮膚病。盡管一般情況下銀屑病不會威脅到患者的生命,卻嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量、工作效率和身心健康。 以往認(rèn)為,銀屑病的病因和發(fā)病機理與遺傳、感染、代謝障礙、內(nèi)分泌、神經(jīng)精神和免疫等多種因素有關(guān)。后有研究發(fā)現(xiàn),環(huán)境因素在銀屑病的發(fā)生和發(fā)展過程中也起重要作用�，F(xiàn)在一致公認(rèn),銀屑病是一種由多基因遺傳決定、多種環(huán)境因素刺激誘導(dǎo)的免疫異常性慢性炎癥性增生性皮膚病。即遺傳背景的多樣性影響基因功能,在環(huán)境因素的作用下,激發(fā)機體的細(xì)胞免疫應(yīng)答,產(chǎn)生以CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫紊亂,從而導(dǎo)致患病。 目前,已有研究表明FOXP3基因及其所影響的CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells, Tri-Treg)參與了許多自身免疫性疾病的發(fā)病機制。Tri-Treg數(shù)量降低,尤其是其與效應(yīng)性T(effectiveness T Cell, Te)細(xì)胞之間免疫失衡,導(dǎo)致Te細(xì)胞過度活化,是重型及進展期尋常型銀屑病(psoriasis vulgaris, PV)病程發(fā)展中的核心環(huán)節(jié)。 近期國內(nèi)已報道,FOXP3基因中個別SNPs位點與銀屑病發(fā)病有相關(guān)性。但是,對于受多基因影響的復(fù)雜性自身免疫性疾病,我們有必要進行大樣本、多位點SNPs檢測,并在此基礎(chǔ)上對FOXP3轉(zhuǎn)錄調(diào)控進行研究,為機制研究提供更多更可靠的靶向分子。 為此,我們選擇與免疫性疾病發(fā)病密切相關(guān)的FOXP3基因,擬在中國PV人群中篩查其SNPs中基因型頻率分布,并對陽性關(guān)聯(lián)位點的生物學(xué)意義進行初步實驗研究。 本研究收集408例PV患者及363例正常對照,采用問卷調(diào)查,多因素logistic回歸分析尋找出與PV發(fā)病相關(guān)的危險因素。 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-連接酶檢測(polymerase chain reaction and ligase detection reaction, PCR-LDR)方法,在中國PV人群中,對FOXP3基因4個SNPs候選位點(rs2232365, rs3761547, rs3761548, rs3761549)進行病例-對照研究。 等位基因頻率直接由基因型計算,Hardy-Weinberg平衡由χ~2檢驗檢測,以P0.05為符合Hardy-Weinberg平衡,兩組間差異由列聯(lián)表χ~2檢測,位點間交互作用使用χ~2檢測,P0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)的計算使用統(tǒng)計分析系統(tǒng)(version 9.0, SAS Institute Inc, Cary NC) 對與PV相關(guān)的FOXP3基因陽性SNP位點(rs2232365, rs3761547A, rs3761549)進行初步的功能研究,即通過實時定量-PCR( realtime- PCR, RT-PCR)法,對比白介素2(Interleukin 2, IL-2)體外刺激前后不同基因型PV患者中FOXP3 mRNA的表達(dá)水平,分析不同基因型對FOXP3基因內(nèi)含子1區(qū)中核酸轉(zhuǎn)錄的影響。 研究主要結(jié)果如下: 1.本次研究發(fā)現(xiàn),有家族史(p0.001, OR=3.12, 95% CI= 2.40-4.07)和40歲以前發(fā)病(p0.001,OR= 1.12, 95% CI= 0.92-1.38)仍然是嚴(yán)重影響PV發(fā)病的因素;一些環(huán)境因素也是PV發(fā)病的危險因素:吸煙( p0.001, OR =3.91, 95% CI=2.68-5.71),飲酒(偶爾飲酒: p=0.037, OR=1.46, 95% CI=1.02-2.09;戒酒: p0.001, OR=5.37, 95% CI=3.21-8.98;繼續(xù)飲酒: p0.001, OR=11.90, 95% CI=7.08-19.98);失業(yè)(p=0.0175, OR=3.72, 95% CI=1.26- 10.97)、未婚(p0.0001, OR=3.93, 95% CI= 2.80-5.52)、睡眠不足(time5h: p0.0001, OR=56.61, 95% CI= 13.56 -236.36; 8htime5h : p0.0001, OR= 10.30, 95% CI=7.16-14.82)以及在城市以外的居住地點(p0.001,郊區(qū): OR=3.72, 95% CI= 2.06-6.72;縣城: OR=40.56, 95% CI= 6.27-101.14;農(nóng)村: OR=26.80, 95% CI= 10.65-67.47),月經(jīng)紊亂(p=0, OR=3.88, 95% CI= 1.88-7.92)。 2.在408例PV患者及363例正常對照中,采用PCR-LDR對FOXP3基因4個SNP位點(rs2232365,rs3761547,rs3761548,rs3761549)進行分型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs2232365,rs3761547和rs3761549等位基因和基因型頻率在PV患者及正常對照組中的分布存在顯著差異(p值均0.05)。 低頻純合子(低頻等位純合基因型)(rs2232365 GG, rs3761547 GG, rs3761549 TT)是PV發(fā)病的保護性基因型,對應(yīng)高頻純合子是危險基因型。攜帶保護性基因型的個體患PV危險性將顯著降低rs2232365 GG: p=0.0206, adjusted OR= 0.38, 95%CI=0.17-0.86; rs3761547 GG: p=0.0288, adjusted OR=0.30, 95% CI=0.10-0.88; rs3761549 TT: p=0.0399,adjusted OR = 0.33, 95% CI = 0.12- 0.95。 3.聯(lián)合各樣本基因型進行分層分析,研究基因多態(tài)性與PV臨床表型的相關(guān)性,結(jié)果顯示:分別以rs2232365 AA ,rs3761547 AA和rs3761549 CC基因型為參照,多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),攜帶三個與疾病關(guān)聯(lián)位點中rs2232365,rs3761547和rs3761549的G等位、G等位、T等位,可以降低發(fā)病年齡40歲患者的發(fā)病率,并可以明顯緩解女性群體的發(fā)病;三個陽性位點中的低頻等位純合子對有家族史患者發(fā)病有降低作用;rs3761547 AG+GG和rs3761549 CT+TT基因型將顯著降低不伴有代謝性疾病人群中PV發(fā)病風(fēng)險性。 4.本實驗發(fā)現(xiàn)FOXP3基因的功能性SNP位點rs3761548與PV的發(fā)病無相關(guān)性。 5.對rs2232365 (位點1),rs3761547 (位點2)和rs3761549 (位點4)進行連鎖不平衡分析提示,三個位點存在連鎖(分別為D’_(1,2)=0.8794, r~2= 0.3927; D’_(1,4)=0.9924, r~2= 0.4223; D’2,4=0.9306, r~2= 0.9455)。 6.對FOXP3基因的多態(tài)性位點之間的交互作用進行分析,統(tǒng)計結(jié)果顯示三個陽性位點之間兩兩存在交互作用,rs2232365與rs3761547、rs2232365與rs3761549C/T、rs3761547與rs3761549之間的聯(lián)合型在患者和健康對照之間的分布存在顯著差異(p值分別為0.0356, 0.0004和0.0043)。其中FOXP3-rs2232365 AA -3761547 AG+GG聯(lián)合基因型可增加PV發(fā)病危險性2.897倍(校正后p=0.0393, 95%CI =1.05 7.97),而rs2232365AG+GG-rs3761547AG+GG(p=0.0019, adjusted OR=0.59, 95% CI= 0.42-0.82)、rs2232365AG+GG-rs3761549CT+TT(p=0.0012, adjusted OR=0.57, 95% CI= 0.41-0.80)、rs3761547AG+GG- rs3761549CT+TT (p=0.0027, adjusted OR=0.62, 95% CI= 0.45-0.85)聯(lián)合基因型顯著降低PV發(fā)病率,分別提示各位點之間具有聯(lián)合效應(yīng)。 7.采用配對和非獨立樣本t檢驗,對IL-2刺激前后外周血白細(xì)胞中FOXP3基因mRNA表達(dá)量進行統(tǒng)計學(xué)比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)任换蚋淖儠r,攜帶保護型基因患者血中FOXP3 mRNA的表達(dá)量明顯增高,與FOXP3基因三個陽性關(guān)聯(lián)的SNP位點保護基因型可降低PV患病風(fēng)險的研究結(jié)果一致。 綜上所述:本研究通過在中國人群中進行病例-對照研究,發(fā)現(xiàn)FOXP3基因rs2232365,rs3761547,rs3761549位點多態(tài)性與中國人群PV發(fā)病相關(guān);三個陽性位點中低頻率等位是保護性等位,而高頻等位是危險性等位。這三個位點存在連鎖, rs2232365 AA - 3761547 AG+GG能顯著增加PV患病的風(fēng)險。FOXP3基因三個陽性位點中高頻率等位基因可能是通過下調(diào)FOXP3基因的表達(dá)而增加了PV發(fā)病風(fēng)險。同時,本實驗還發(fā)現(xiàn),伴有家族史和發(fā)病年齡在40歲以前是PV發(fā)病的危險因素;一些環(huán)境因素對PV的發(fā)病有密切關(guān)系,在城市以外的居住環(huán)境下、未婚狀態(tài)、失業(yè)狀況女性激素水平紊亂與PV的發(fā)病呈正向關(guān),那些吸煙與飲酒者也更易患PV。 總之,本研究表明FOXP3基因的SNPs與PV發(fā)病相關(guān),該基因的SNP可能通過影響轉(zhuǎn)錄水平而導(dǎo)致發(fā)病。一些環(huán)境因素與PV發(fā)病有密切的關(guān)聯(lián)。支持遺傳與環(huán)境共同作用學(xué)說是銀屑病重要的發(fā)病機理之一。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R758.63

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 關(guān)寧;沈柱;劉玉峰;;尋常型銀屑病患者治療前后外周血中單個核細(xì)胞Foxp3 mRNA水平的檢測分析[J];中國皮膚性病學(xué)雜志;2007年05期

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本文編號：2493804