【摘要】：研究目的:血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimimcry,VM):是一種非內(nèi)皮細胞依賴性的腫瘤內(nèi)血管生成模式,是高侵襲性腫瘤細胞,通過自身變形和基質(zhì)重塑而圍成的血管樣通道,管壁由一層PAS陽性基底膜圍成,外襯以腫瘤細胞,管道內(nèi)有血液流動。VM的形成可使腫瘤細胞達到自身血液供應(yīng)的目的。VM常見于黑色素瘤、胃腸道間質(zhì)瘤、卵巢癌、乳腺癌等高侵襲性腫瘤中。具有VM結(jié)構(gòu)的腫瘤往往惡性程度高、血道轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差。因黑色素瘤中VM的發(fā)生率較高,且針對內(nèi)皮細胞的抗腫瘤血管生成藥物對腫瘤細胞自身圍成的脈管不起作用,因此,明確VM的分子機制,對黑色素瘤的治療意義重大。本實驗第一部分提示,Rictor,哺乳動物雷帕霉素復合體2(mTORC2)的核心成分,在人體黑色素瘤組織中高表達,且與腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移及VM的形成成正相關(guān)。但目前對Rictor在黑色素瘤VM中的作用機制尚不清楚,本實驗研究中,我們采用基于慢病毒的小RNA干擾技術(shù)及一系列分子生物學技術(shù),分析討論Rictor對黑色素瘤VM的影響及其可能的分子機制,期待能為其臨床治療提供新的思路。研究方法:1)采用免疫組化及CD34/PAS雙重染色的方法,分析Rictor在81例人體黑色素瘤組織標本中的表達情況,及其與VM和其余臨床病理資料之間的關(guān)系。2)采用Western Blotting實驗方法首先驗證了Rictor質(zhì)粒降表達Rictor的效率。選擇下調(diào)顯著序列,采用基于慢病毒的小RNA干擾技術(shù),下調(diào)人皮膚黑色素瘤A375細胞系及人葡萄膜黑色素瘤MUM-2B細胞系中Rictor的表達水平,研究其下調(diào)對黑色素瘤細胞三維成管能力的影響。3)采用MTT實驗及流式細胞術(shù)檢測細胞周期,研究下調(diào)Rictor表達對A375及MUM-2B細胞增殖能力和周期的影響。4)采用劃痕實驗及Transwell遷移實驗,觀察下調(diào)Rictor表達對黑色素瘤A375及MUM-2B細胞遷移能力的影響;采用Transwell侵襲實驗,分析下調(diào)Rictor表達對A375及MUM-2B細胞侵襲能力的影響;采用粘附實驗,分析下調(diào)Rictor表達對A375及MUM-2B細胞外基質(zhì)粘附能力的影響。5)采用Western Blotting,分析Rictor表達下調(diào)對其下游關(guān)鍵分子AKT磷酸化的影響及AKT下游MMP-2及MMP-9蛋白表達的影響;采用Real-Time PCR分析Rictor表達下調(diào)對MMP-2及MMP-9 mRNA水平的影響;采用明膠酶譜實驗分析Rictor表達下調(diào)對MMP-2及MMP-9活性的影響。6)為進一步驗證Rictor對A375及MUM-2B細胞MMP-2/9的表達及活性的影響是通過Rictor-AKT-MMP-2/9途徑,向A375及MUM-2B細胞中加入不同濃度的AKT抑制劑(MK-2206),采用Western Blotting方法分析抑制AKT對其下游MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響;且采用明膠酶譜實驗方法分析抑制AKT對其下游MMP-2和MMP-9活性的影響。研究結(jié)果:1)免疫組化及CD34/PAS雙染提示,在81例人體黑色素瘤組織標本中,Rictor高表達組織有57例,其中有36例與復發(fā)與轉(zhuǎn)移有關(guān),31例可見VM結(jié)構(gòu)。此外,Rictor陽性組術(shù)后生存時間短于Rictor陰性組,預(yù)后更差;2)三維成管實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,Rictor表達下調(diào)抑制了A375及MUM-2B細胞三維管道的形成;3)細胞增殖實驗結(jié)果顯示,Rictor表達下調(diào)抑制了A375及MUM-2B細胞增殖能力;流式細胞術(shù)檢測細胞周期進一步證實Rictor對A375及MUM-2B細胞增殖的影響具體表現(xiàn)為G2/M期細胞阻滯,大量細胞堆積于G2期(DNA合成后期)而不能進入M期(有絲分裂期)使得細胞增殖受到影響;4)劃痕、Transwell遷移侵襲及粘附實驗結(jié)果顯示,下調(diào)Rictor表達能抑制A375及MUM-2B細胞遷移侵襲能力及對細胞外基質(zhì)的粘附能力;5)Western Blotting結(jié)果顯示,Rictor降表達能抑制下游AKT 473位點及308位點的磷酸化,同時抑制了AKT下游MMP-2及MMP-9蛋白水平的表達;Real-Time PCR結(jié)果顯示,Rictor降表達亦能抑制MMP-2和MMP-9 mRNA水平的表達;明膠酶譜實驗結(jié)果顯示,下調(diào)Rictor的表達能抑制A375及MUM-2B細胞MMP-2和MMP-9的活性;6)Western Blotting結(jié)果顯示,采用不同濃度的AKT抑制劑對AKT進行抑制后,其下游MMP-2和MMP-9蛋白的表達受到抑制;同時明膠酶譜結(jié)果提示,抑制AKT能抑制MMP-2和MMP-9的活性。研究結(jié)論:1)黑色素瘤中存在VM,且VM結(jié)構(gòu)與黑色素瘤的不良預(yù)后呈正相關(guān)Rictor在人體黑色素瘤組織中呈高表達,且其表達與腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移及VM呈正相關(guān),與患者的生存時間呈負相關(guān),提示Rictor是黑色素瘤預(yù)后不良的指標之一。2)Rictor、AKT及MMP-2在人體黑色素瘤中均呈高表達。且Rictor(+)、AKT(+)、MMP-2(+)及VM結(jié)構(gòu)的存在,均與黑色素瘤的預(yù)后生存時間呈負相關(guān),提示Rictor、AKT、MMP-2及VM均為黑色素瘤不良預(yù)后的指標;3)在A375及MUM-2B黑色素瘤細胞中,Rictor下調(diào)可通過抑制細胞增殖(G2/M阻滯)、運動及對細胞外基質(zhì)的粘附能力而抑制細胞的三維成管能力,進而抑制VM的形成。4)進一步研究發(fā)現(xiàn),Rictor對VM的調(diào)控,是通過調(diào)節(jié)其下游AKT磷酸化,進而調(diào)控AKT下游MMP-2和MMP-9的表達及活性來實現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.5

【參考文獻】

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本文編號：2463698