【摘要】：背景:一氧化氮(nitric oxide, NO)是一種具有多種生物學(xué)活性的新型生物信息分子,調(diào)節(jié)多種生理病理反應(yīng),并參與銀屑病、紅斑狼瘡、變態(tài)反應(yīng)性疾病及某些皮膚腫瘤的致病過程。皮膚組織中多種細(xì)胞能合成NO,其合成分泌受多種因素調(diào)節(jié)。但NO在皮膚細(xì)胞炎癥反應(yīng)、增殖與凋亡方面的作用仍不很明確。復(fù)方甘草酸苷(Compound Glycyrrhizin, CG)是從中藥甘草根部提取,以甘草酸苷為主要成分,具有抗炎、抗過敏、免疫調(diào)節(jié)、類激素樣等藥理作用。在銀屑病、變態(tài)反應(yīng)性皮膚病的治療中取得較好療效,但其作用機(jī)制尚不清楚。 目的:本研究旨在研究一氧化氮(NO)對(duì)正常皮膚炎癥反應(yīng)的作用,對(duì)正常及紫外線照射后人表皮細(xì)胞凋亡的影響。同時(shí)研究復(fù)方甘草酸苷對(duì)培養(yǎng)的人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)增殖凋亡的作用,及復(fù)方甘草酸苷對(duì)HaCaT細(xì)胞合成分泌NO、iNOS表達(dá)的影響。以探討復(fù)方甘草酸苷調(diào)節(jié)HaCaT細(xì)胞增殖、凋亡作用的機(jī)制,為復(fù)方甘草酸苷用于皮膚病治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:(1)NO對(duì)皮膚的致炎癥作用:于12例健康人皮膚外用5%亞硝酸鹽及不同濃度沸石一氧化氮霜,通過真皮血流變化曲線確定與5%亞硝酸鹽產(chǎn)生相近NO生理效應(yīng)的沸石一氧化氮霜的濃度,并通過化學(xué)發(fā)光法比較二者真皮淺層NO含量。將5%亞硝酸鹽、33%沸石一氧化氮、33%沸石及2%抗壞血酸霜外用于正常皮膚48小時(shí)后,應(yīng)用組織切片HE染色及CD3、CD4、CD8、CD68、CD1a及中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶免疫組化染色觀察表皮及真皮炎癥反應(yīng),鏡下計(jì)數(shù)陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù),應(yīng)用ELISA法測定二者外用后表皮負(fù)壓吸引皰皰液中IL-4及IFN-γ水平。(2)NO對(duì)紫外線(UV)誘導(dǎo)表皮細(xì)胞凋亡的作用:測定12例志愿者311nm中波紫外線(UVB)照射后最小紅斑量(MED),以2倍MED的UVB照射右前臂屈側(cè)皮膚,于照射及非照射部位均外用33%沸石一氧化氮霜及空白對(duì)照劑,24小時(shí)后取皮膚活檢,應(yīng)用組織切片HE染色和Caspase3、p53免疫組化染色檢測表皮細(xì)胞凋亡,比較各組凋亡細(xì)胞數(shù)。(3)細(xì)胞學(xué)研究:將不同濃度的CG作用于體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞,在24、48及72小時(shí)采用CCK8法檢測CG對(duì)HaCaT細(xì)胞體外增殖的影響,硝酸還原酶法檢測HaCaT細(xì)胞分泌的NO含量,根據(jù)CCK8結(jié)果用流式細(xì)胞儀測定CG作用后48小時(shí)細(xì)胞凋亡率,逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測48小時(shí)HaCaT細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)mRNA的表達(dá),分析其相對(duì)表達(dá)量,Western免疫印跡檢測HaCaT細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果:①二種NO供體外用于皮膚后,33%沸石一氧化氮霜與5%亞硝酸鹽霜血流曲線相近,前者真皮淺層NO水平略高于后者,二者比較無明顯差異(P0.05)。②炎癥細(xì)胞結(jié)果:二者外用于皮膚后,33%亞硝酸鹽組表皮CD68+細(xì)胞較正常對(duì)照明顯增多(P0.05),真皮CD3+、CD4+、CD68+及中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶陽性細(xì)胞較正常對(duì)照明顯升高(P0.05)。而外用33%沸石一氧化氮霜組真皮中CD4+細(xì)胞明顯增高(P0.01),其他炎癥細(xì)胞與正常對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P0.05)。③ELISA法測定外用33%沸石一氧化氮霜后表皮負(fù)壓吸引皰皰液中IFN-γ水平較正常對(duì)照顯著增高,IL-4水平未測出。④細(xì)胞凋亡結(jié)果:2倍MED紫外線照射后表皮細(xì)胞凋亡明顯增加(P0.01),外用NO供體誘導(dǎo)表皮細(xì)胞凋亡不明顯(P0.05)。紫外線照射后24小時(shí),外用NO供體處凋亡的表皮細(xì)胞較外用對(duì)照劑處明顯減少(P0.05)。⑤CCK8及流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果:不同濃度的CG對(duì)HaCaT細(xì)胞的作用不同。低濃度CG促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,100ug/ml時(shí)增殖率最高、凋亡率最低,較對(duì)照組有顯著差異;中高濃度CG促HaCaT細(xì)胞增殖作用減弱,促凋亡作用增強(qiáng),1000ug/ml時(shí)明顯抑制HaCaT細(xì)胞增殖,上述作用48小時(shí)即明顯。⑥NO水平:不同濃度CG在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌NO的濃度呈現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)趨勢,低濃度促進(jìn)NO分泌,高濃度抑制NO分泌。24小時(shí)CG濃度為20μg /ml時(shí)NO水平達(dá)高峰(708.3±17.7μg /ml),較對(duì)照組顯著增高(P0.05),48及72小時(shí)CG濃度40μg /ml時(shí)NO分泌達(dá)高峰,但與未加藥組比均無顯著差異。⑦RT-PCR及Western免疫印跡結(jié)果:CG作用48小時(shí)在低濃度時(shí)促進(jìn)HaCaT細(xì)胞iNOSmRNA及iNOS蛋白表達(dá),高濃度時(shí)抑制表達(dá),均表現(xiàn)濃度依賴性,100ug/ml時(shí)表達(dá)最強(qiáng),1000ug/ml時(shí)表達(dá)最低,較對(duì)照組均有顯著性差異(P0.05)。 結(jié)論:①3 3%沸石亞硝基化霜與5%亞硝酸鹽霜外用于正常人皮膚可產(chǎn)生相近的生理學(xué)效應(yīng)。②5%亞硝酸鹽霜外用引起表皮及真皮明顯炎癥反應(yīng),33%沸石一氧化氮霜對(duì)表皮無明顯致炎癥作用,僅可引起真皮內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤,以Th1細(xì)胞浸潤為主。③2倍MED的UVB照射可顯著誘發(fā)正常人表皮細(xì)胞凋亡,NO對(duì)正常人表皮細(xì)胞無明顯致凋亡作用,對(duì)UVB照射誘發(fā)的表皮細(xì)胞凋亡有明顯抑制作用。④復(fù)方甘草酸苷對(duì)HaCat細(xì)胞增殖凋亡的影響隨濃度變化不同,低濃度時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制凋亡;高濃度時(shí)抑制增殖,促進(jìn)凋亡。可能與CG調(diào)節(jié)HaCaT細(xì)胞iNOS表達(dá)有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R285.5;R758.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2444891