【摘要】：背景:一氧化氮(nitric oxide, NO)是一種具有多種生物學活性的新型生物信息分子,調節(jié)多種生理病理反應,并參與銀屑病、紅斑狼瘡、變態(tài)反應性疾病及某些皮膚腫瘤的致病過程。皮膚組織中多種細胞能合成NO,其合成分泌受多種因素調節(jié)。但NO在皮膚細胞炎癥反應、增殖與凋亡方面的作用仍不很明確。復方甘草酸苷(Compound Glycyrrhizin, CG)是從中藥甘草根部提取,以甘草酸苷為主要成分,具有抗炎、抗過敏、免疫調節(jié)、類激素樣等藥理作用。在銀屑病、變態(tài)反應性皮膚病的治療中取得較好療效,但其作用機制尚不清楚。 目的:本研究旨在研究一氧化氮(NO)對正常皮膚炎癥反應的作用,對正常及紫外線照射后人表皮細胞凋亡的影響。同時研究復方甘草酸苷對培養(yǎng)的人永生化角質形成細胞(HaCaT細胞)增殖凋亡的作用,及復方甘草酸苷對HaCaT細胞合成分泌NO、iNOS表達的影響。以探討復方甘草酸苷調節(jié)HaCaT細胞增殖、凋亡作用的機制,為復方甘草酸苷用于皮膚病治療提供實驗依據。 方法:(1)NO對皮膚的致炎癥作用:于12例健康人皮膚外用5%亞硝酸鹽及不同濃度沸石一氧化氮霜,通過真皮血流變化曲線確定與5%亞硝酸鹽產生相近NO生理效應的沸石一氧化氮霜的濃度,并通過化學發(fā)光法比較二者真皮淺層NO含量。將5%亞硝酸鹽、33%沸石一氧化氮、33%沸石及2%抗壞血酸霜外用于正常皮膚48小時后,應用組織切片HE染色及CD3、CD4、CD8、CD68、CD1a及中性粒細胞彈性蛋白酶免疫組化染色觀察表皮及真皮炎癥反應,鏡下計數陽性反應細胞數,應用ELISA法測定二者外用后表皮負壓吸引皰皰液中IL-4及IFN-γ水平。(2)NO對紫外線(UV)誘導表皮細胞凋亡的作用:測定12例志愿者311nm中波紫外線(UVB)照射后最小紅斑量(MED),以2倍MED的UVB照射右前臂屈側皮膚,于照射及非照射部位均外用33%沸石一氧化氮霜及空白對照劑,24小時后取皮膚活檢,應用組織切片HE染色和Caspase3、p53免疫組化染色檢測表皮細胞凋亡,比較各組凋亡細胞數。(3)細胞學研究:將不同濃度的CG作用于體外培養(yǎng)的HaCaT細胞,在24、48及72小時采用CCK8法檢測CG對HaCaT細胞體外增殖的影響,硝酸還原酶法檢測HaCaT細胞分泌的NO含量,根據CCK8結果用流式細胞儀測定CG作用后48小時細胞凋亡率,逆轉錄一聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測48小時HaCaT細胞誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)mRNA的表達,分析其相對表達量,Western免疫印跡檢測HaCaT細胞iNOS蛋白表達水平。 結果:①二種NO供體外用于皮膚后,33%沸石一氧化氮霜與5%亞硝酸鹽霜血流曲線相近,前者真皮淺層NO水平略高于后者,二者比較無明顯差異(P0.05)。②炎癥細胞結果:二者外用于皮膚后,33%亞硝酸鹽組表皮CD68+細胞較正常對照明顯增多(P0.05),真皮CD3+、CD4+、CD68+及中性粒細胞彈性蛋白酶陽性細胞較正常對照明顯升高(P0.05)。而外用33%沸石一氧化氮霜組真皮中CD4+細胞明顯增高(P0.01),其他炎癥細胞與正常對照組比較無統(tǒng)計學差別(P0.05)。③ELISA法測定外用33%沸石一氧化氮霜后表皮負壓吸引皰皰液中IFN-γ水平較正常對照顯著增高,IL-4水平未測出。④細胞凋亡結果:2倍MED紫外線照射后表皮細胞凋亡明顯增加(P0.01),外用NO供體誘導表皮細胞凋亡不明顯(P0.05)。紫外線照射后24小時,外用NO供體處凋亡的表皮細胞較外用對照劑處明顯減少(P0.05)。⑤CCK8及流式細胞儀檢測結果:不同濃度的CG對HaCaT細胞的作用不同。低濃度CG促進細胞增殖,抑制細胞凋亡,100ug/ml時增殖率最高、凋亡率最低,較對照組有顯著差異;中高濃度CG促HaCaT細胞增殖作用減弱,促凋亡作用增強,1000ug/ml時明顯抑制HaCaT細胞增殖,上述作用48小時即明顯。⑥NO水平:不同濃度CG在各時間點對HaCaT細胞分泌NO的濃度呈現出雙向調節(jié)趨勢,低濃度促進NO分泌,高濃度抑制NO分泌。24小時CG濃度為20μg /ml時NO水平達高峰(708.3±17.7μg /ml),較對照組顯著增高(P0.05),48及72小時CG濃度40μg /ml時NO分泌達高峰,但與未加藥組比均無顯著差異。⑦RT-PCR及Western免疫印跡結果:CG作用48小時在低濃度時促進HaCaT細胞iNOSmRNA及iNOS蛋白表達,高濃度時抑制表達,均表現濃度依賴性,100ug/ml時表達最強,1000ug/ml時表達最低,較對照組均有顯著性差異(P0.05)。 結論:①3 3%沸石亞硝基化霜與5%亞硝酸鹽霜外用于正常人皮膚可產生相近的生理學效應。②5%亞硝酸鹽霜外用引起表皮及真皮明顯炎癥反應,33%沸石一氧化氮霜對表皮無明顯致炎癥作用,僅可引起真皮內CD4+T淋巴細胞浸潤,以Th1細胞浸潤為主。③2倍MED的UVB照射可顯著誘發(fā)正常人表皮細胞凋亡,NO對正常人表皮細胞無明顯致凋亡作用,對UVB照射誘發(fā)的表皮細胞凋亡有明顯抑制作用。④復方甘草酸苷對HaCat細胞增殖凋亡的影響隨濃度變化不同,低濃度時促進細胞增殖,抑制凋亡;高濃度時抑制增殖,促進凋亡�？赡芘cCG調節(jié)HaCaT細胞iNOS表達有關。
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【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R285.5;R758.6

【參考文獻】

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本文編號：2444891