【摘要】：銀屑病是一種受多種因素影響的斑塊鱗屑性慢性炎癥性皮膚,以表皮增生過度及角化不全為主要特征,癥狀的嚴重程度不等,從較小的局部斑塊至累及全身。它具有反復性,難以根治。它影響到2%-3%的總人口,是全球最為常見的自身免疫疾病之一。它影響著全世界所有地區(qū),在北美和歐洲,銀屑病是成年人中最普遍的免疫介導性皮膚病,影響著大約2500萬人。而在中國,銀屑病的患病率為0.123%,其中男性多于女性,北方多于南方,城市高于農村。在非洲國家的發(fā)病率則比較低。銀屑病的發(fā)病不但存在顯著的種族差異、性別差異,在地理和季節(jié)上差異也很顯著。高寒地區(qū)的發(fā)病率明顯高于溫暖地區(qū),而冬春季病情可能加重夏季則自然減輕。 現代的研究認為銀屑病是一種多基因遺傳背景下的T細胞異常的自身免疫疾病,有關角質細胞、T細胞、中性粒細胞、神經細胞等在銀屑病中的作用以及各種細胞之間復雜的相互作用等方面的探索和爭論不斷的揭示著其發(fā)病機理,推動著醫(yī)學的發(fā)展,同時也促進人們尋找更有效的抗銀屑病藥物,為人類的健康發(fā)展提供支持。 銀屑病的藥物治療按嚴重程度分別選用局部用藥物、光療法、傳統口服藥物和新型生物制劑。若患者的銀屑病對局部用藥物和光療法治療都無適當響應或疾病累及皮膚已十分廣泛,則需及時改用全身用藥物。傳統口服用銀屑病治療藥物主要有類維生素A類物質、甲氨蝶呤(methotrexate)、環(huán)孢素(ciclosporin)和阿西曲汀(acitretine)等,它們治療銀屑病有效并具有使用簡便和價格低廉的優(yōu)勢,但對肝、腎和骨髓的毒性較大并存在致畸性,實際應用受到一定的限制。生物制劑與傳統全身用藥物相比,能夠特異性地靶向免疫系統因而具有更好的安全性和耐受性,所以適于用作更長期的銀屑病治療藥物。歐美至今已批準了6種銀屑病治療用生物制劑。其中一類靶向與銀屑病發(fā)病機制相關的T細胞,但由于療效差,目前臨床應用已大為減少；另一類TNF抑制劑為治療中至重度銀屑病一線藥物。生物制劑對普通患者來說,價格昂貴,安全性仍然有限。 中醫(yī)治療方法頗多,相應地出現了很多的治療方藥,青黛膠囊、雷公藤片、丹參注射液、清開靈注射液等在臨床應用中得到了大力推廣,并獲得了良好的療效；其它一些復方中藥制劑和單味中藥提取物如銀杏葉內脂、氧化苦參堿、喜樹果涂膜劑、去氫駱駝蓬堿軟膏等治療本病亦顯示出一定的效果和發(fā)展勢頭。由于中醫(yī)藥治療銀屑病可延長復發(fā)時間,不良反應小,療效確切,其治療上的優(yōu)勢不容忽視。 但是由于中藥復方有效成分不明確,并且目前中國藥典中藥復方質量控制大多采用單一指標成分定量的方法,該方法不能全面客觀的反應中藥內在質量,而且不符合中藥整體性的特點,存在一定的局限性。中藥制品質量和安全性評價方法還不夠完善,不能實現中藥質量穩(wěn)定可控的要求,因此中藥復方至今未得到國際主流藥物市場的承認。 由于銀屑病的頑固性特點及中西藥在治療上的獨特缺陷,中醫(yī)中藥治療銀屑病具有廣闊的研究空間。在基礎研究方面,應進一步深化研究中醫(yī)藥內外治療銀屑病的作用機理,建立中醫(yī)辨證分型的實驗動物模型,統一實驗分型標準和實驗室觀察指標,更深層次闡明內外用中藥制劑的藥理學作用機制。由此,通過完善而系統的實驗研究,以中醫(yī)辨證分型論治為基礎,以實驗室指標為依據,開發(fā)出療效確切的中藥單體或復方,探索有效的作用靶點,進而闡明其作用機制,是今后中醫(yī)藥治療銀屑病實驗研究的主要方向。 鑒于銀屑病的特征及其治療藥物的研究現狀,更多地開發(fā)治療銀屑病的相關中藥制劑,在完善中藥研究資料、充分發(fā)揮中藥毒副作用小的優(yōu)勢的同時,盡可能提高其質控水平、避免中藥的質量評價與其作用整體性相違背的劣勢,對銀屑病治療藥物發(fā)展具有重要意義。 經對銀屑病的特征、發(fā)病機制及銀屑病藥物治療現狀的認識,通過對《中藥大辭典》相關組方的特性進行研究,綜合國內同類制劑的療效考察,我們進行了銀屑病治療藥物的研究。 本論文通過研究銀屑病治療藥物YXD09的組方,質量控制標準,生產工藝優(yōu)化,運用小鼠陰道上皮細胞模型、尾部皮膚鱗片模型和離體透皮試驗,豐富本藥物的藥效學和藥代動力學,完善其非臨床研究內容,為銀屑病的治療提供實驗依據。 (1)銀屑病治療藥物YXD09的組方研究 通過對銀屑病治療狀況的認識,針對銀屑病的特征及發(fā)病機制,又根據《中藥大辭典》中各藥味的功能特性及應用情況,建立銀屑病治療藥物YXD09的組方。 (2)制備工藝優(yōu)化研究 本試驗選擇回流時間(A)、回流次數(B)、乙醇濃度(C)、乙醇用量(D)為考察因素,以大黃素含量為評價指標,用L9(34)正交試驗設計進行試驗。按十分之一處方量秤取藥材,共9份,按正交試驗方案進行提取并濃縮至總體積的50%得YXD09,將濃縮液濾過,精密吸取濾過液20mL,以HPLC法測定YXD09中大黃素的含量。 結果表明,影響最佳工藝的因素順序為：乙醇濃度回流時間回流次數乙醇用量,且最佳工藝參數為：C3A2B2D2。方差分析表明,4種工藝因素對大黃素的含量均沒有顯著差異(P0.05)。因而在實際生產中,為了降低生產成本,縮短生產周期,將回流時間定為2小時,而不用4小時。因此,最后選擇的YXD09醇提優(yōu)化條件為A1B2C3D2,即回流2小時,回流2次,乙醇濃度為80%,乙醇用量為8倍。 選用大黃、羊蹄和虎杖3味中藥材及其余藥味考察合并醇提與分開醇提對大黃素含量的影響。結果顯示,合并醇提液和分開醇提液中的大黃素含量分別為162.78ug/ml和161.22ug/ml.采用EXCEL軟件對其結果進行方差分析,發(fā)現P0.05,說明兩種醇提液中大黃素的含量沒有顯著差異。 (3)質量控制研究 采用薄層色譜法對YXD09中大黃素和當歸進行了定性分析。依照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VIB)試驗,分別吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性對照品溶液3種溶液各10μl,分別點于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(30℃-60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15：5：1)為展開劑,展開,取出,晾干,將硅膠G薄層板置于365nm紫外光燈下檢視,對大黃和當歸進行薄層色譜鑒別。結果顯示,使用薄層色譜法鑒別YXD09中的大黃和當歸,操作簡單,重現性好,效果明顯,可以做為YXD09的薄層鑒別標準。 通過高效液相色譜法測定了YXD09中大黃素的含量。色譜條件是色譜柱：ZORBAX Extend-C18(4.6mm×150mm,5μm)色譜柱；流動相：0-6min時,甲醇：水(40：60)；6-20min時,甲醇：水：0.1%磷酸(75：10：15),梯度洗脫；流速：1.0ml/min;檢測波長：254nm；柱溫：35℃。高效液相色譜法測定三個批次的YXD09中大黃素含量分別為166.83、172.52、160.43μg/ml,RSD值分別為1.7%、1.3%、1.1%。 首次采用了薄層色譜法,對YXD09中大黃和當歸進行了定性分析,通過方法學考察了高效液相色譜法可以簡便有效地測定YXD09中所含大黃素的總量,定性與定量相輔相成,檢驗方法既全面可靠又具有一定的專屬性,為YXD09的質量控制及藥效物質基礎的研究提供了基礎,尤其是對大黃素的檢測及含量測定,可以作為YXD09的質量控制標準。 同時又對大黃素及蛇床子素的同時定量方法進行了研究。 (4)藥效學研究 利用小鼠陰道上皮細胞模型探討YXD09對雌激素周期小鼠陰道上皮細胞有絲分裂的影響。選取造模成功的健康昆明種雌性小鼠30只,隨機分為3組,每組10只小鼠,分別為： YXD09組,陽性對照組,模型組；另隨機取沒有造模的健康昆明種小鼠10只,作為空白試驗組。正式試驗期為7d。第7d開始給藥：YXD09組采用自制陰道灌流器,每次灌注5分鐘；空白組、模型組采用同樣方法灌流生理鹽水10mL/kg;陽性對照組于小鼠陰道壁均勻涂抹一層0.02%的丙酸氯倍他索軟膏。最后一次給藥1h后,各組小鼠于腹腔注射秋水仙堿15mg/kg,使有絲分裂終止在細胞分裂中期,取陰道標本,置于10%的福爾馬林溶液固定,石蠟包埋,HE染色,于普通光學顯微鏡下計數。結果表明,YXD09可抑制雌激素周期小鼠陰道上皮細胞的有絲分裂,效果與丙酸氯倍他索軟膏相似(P0.05)。 利用鼠尾鱗片表皮模型探討銀屑凈對小鼠尾部鱗片表皮顆粒層形成的影響。選取體重相近、健康昆明種小鼠30只,隨機分為3組,分別為：YXD09組,陽性對照組,空白組,每組10只小鼠,公母各半。正式試驗期為7d。分別在YXD09組小鼠尾部均勻涂抹一層相應的藥物,陽性對照組小鼠尾部涂抹丙酸氯倍他索軟膏,空白組小鼠尾部則涂抹生理鹽水。在第7天處死小鼠,取小鼠尾部距離尾根約2cm處背面皮膚一長條,置于10%的福爾馬林溶液固定,石蠟包埋,HE染色,于普通光學顯微鏡下對每個標本逐個觀察鱗片,看鱗片表皮是否有顆粒層形成。結果表明,陽性對照組和YXD09組小鼠尾部含顆粒層鱗片所占比例均極顯著提高(P0.01),分別提高70.1%、116.1%。YXD09的效果明顯優(yōu)于丙酸氯倍他索軟膏(P0.05)。 這些結果提示,YXD09可能通過抑制表皮細胞的過度增殖和促進表皮細胞角質化來達到抗銀屑病的目的,并在抗銀屑病的臨床應用具有廣闊的前景。 (5)藥代動力學研究 運用SD大鼠腹部皮膚作為皮膚模型,采用高效液相色譜法測定了YXD09中大黃素的單位面積累積透過量和皮膚滯留量,探討了YXD09的體外藥代動力學。采用水平式Franz擴散池,擴散池體積為3.5ml,有效擴散面積為1.13cm2,恒溫水浴加熱,溫度控制在32℃左右,轉速為250rpm,接受介質為30%PEG-生理鹽水,排除接受池中的氣泡,向擴散池中加入3.5ml的YXD09藥液。分別于1,2,4,6,8,10,12,24h時取樣1ml,經0.22gm濾膜過濾,取續(xù)濾液,測定大黃素的單位面積累積透過量和皮膚滯留量。結果顯示,YXD09中大黃素的體外透皮釋放方程為Q=0.338t-1.411(R=0.9972),24h的累積滲透量為6.76μg/cm2,皮膚滯留量為19.10gg/cm2。表明YXD09中大黃素以零級動力學經皮膚滲透。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R758.63
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