【摘要】：惡性黑色素瘤是一種起源于黑色素細(xì)胞惡性度極高的皮膚腫瘤,近年來(lái)其發(fā)病率逐年攀升。早期發(fā)現(xiàn)的惡性黑色素瘤可以通過(guò)手術(shù)治愈,但一旦進(jìn)入快速生長(zhǎng)期,它能夠迅速擴(kuò)散到機(jī)體多個(gè)器官,預(yù)后差,死亡率非常高。目前,國(guó)際上尚沒(méi)有系統(tǒng)有效的治療方案能夠延長(zhǎng)患者的生存期。所以,深入探討惡性黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制,尋找基于病因?qū)W的潛在分子靶點(diǎn),對(duì)惡性黑色素瘤的治療具有重要意義。 蛋白磷酸化絲/蘇-脯氨酸的異構(gòu)調(diào)節(jié)是繼蛋白磷酸化后一個(gè)新的調(diào)節(jié)機(jī)制,主要關(guān)系到細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化。其關(guān)鍵酶——人肽脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶(Pin1),能夠特異識(shí)別并催化磷酸化絲/蘇-脯氨酸模序發(fā)生異構(gòu),導(dǎo)致蛋白由順式變?yōu)榉词?調(diào)節(jié)其功能。研究表明,Pinl在多種人類(lèi)腫瘤中過(guò)表達(dá),它參與整合并放大多種致癌信號(hào),被稱(chēng)為腫瘤發(fā)生發(fā)展的“催化分子”。Bao等人的研究表明,Pin1在惡性黑色素瘤中呈過(guò)度表達(dá),但Pin1是否促進(jìn)了惡性黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展,抑制Pin1是否能抑制惡性黑色素瘤的進(jìn)程,仍不得而知。 因此,本實(shí)驗(yàn)中選取惡性度和侵襲轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)的人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞株作為研究對(duì)象,采用人工構(gòu)建的miRNA質(zhì)粒特異沉默Pin1基因的表達(dá),從體內(nèi)、外水平檢測(cè)了Pin1基因沉默對(duì)A375細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等能力的影響。 首先,通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,用Western Blot方法,從Invitrogen公司提供的4條miRNA質(zhì)粒中挑選了一條沉默效率最高的質(zhì)�！猰iRNA plas4。繼而,通過(guò)miRNA plas4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞,得到了兩株穩(wěn)定沉默Pin1的單克隆細(xì)胞株,相對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照的克隆株—Mock,其沉默效率分別為85%和84%。 為了闡明Pin1是否參與了人惡性黑色素瘤的增殖過(guò)程,通過(guò)體外生長(zhǎng)曲線法與腫瘤細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn),觀察了沉默Pin1對(duì)A375細(xì)胞增殖的影響。研究結(jié)果表明,穩(wěn)定沉默Pinl的A375細(xì)胞,生長(zhǎng)速度明顯減慢,集落形成能力也大大降低。這說(shuō)明Pin1確實(shí)對(duì)A375的增殖起到了促進(jìn)作用。另外,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的細(xì)胞周期結(jié)果也顯示,穩(wěn)定沉默Pin1的兩株克隆,均出現(xiàn)了Go/G1期阻滯。 由于惡性黑色素瘤是一種高侵襲轉(zhuǎn)移的腫瘤,也正是由于其高侵襲轉(zhuǎn)移性導(dǎo)致了患者高死亡率及預(yù)后不良,所以,為了探討Pin1是否與惡性黑色素瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān),我們親本A375細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照細(xì)胞—Mock、以及兩株穩(wěn)定沉默Pin1的細(xì)胞,進(jìn)行了體外粘附實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)與穿膜試驗(yàn)。結(jié)果表明,沉默細(xì)胞中的Pin1,可以顯著降低A375細(xì)胞的異質(zhì)粘附、運(yùn)動(dòng)以及侵襲轉(zhuǎn)移能力。 為了在體內(nèi)水平進(jìn)一步探討Pin1的作用,用Mock以及兩株穩(wěn)定沉默Pin1的克隆進(jìn)行了裸鼠異體移植瘤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,沉默細(xì)胞中的Pin1可以顯著降低A375細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的致瘤性。 最后,為了從分子水平上闡明沉默Pin1所發(fā)揮的這些效應(yīng),究竟是源于對(duì)哪些原癌蛋白的抑制,采用Western Blot的方法,初步檢測(cè)了一些曾報(bào)道或未報(bào)道過(guò)的與Pin1相關(guān)的蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,在穩(wěn)定沉默Pin1的兩株克隆中,與腫瘤惡性增殖、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的pAkt(Ser473)/Akt比值明顯降低,JNK水平、MMP-2酶原水平明顯降低,而克隆2中原癌蛋白Her2和CyclinDl的表達(dá)水平也顯著降低。 綜上所述,Pin1與人惡性黑色素瘤的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān),沉默細(xì)胞中的Pin1,可以同時(shí)抑制多種與腫瘤惡性增殖、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的原癌蛋白,從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展,Pin1很可能成為一個(gè)新的治療惡性黑色素瘤的靶點(diǎn)。 Pin1是1996年在酵母雙雜中發(fā)現(xiàn)的一種和有絲分裂激酶有相互作用的蛋白。它屬于肽脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶大家族中的微小菌素(Parvulins)亞家族,能夠通過(guò)識(shí)別磷酸化的絲/蘇氨酸-脯氨酸模序,導(dǎo)致底物蛋白發(fā)生構(gòu)象改變,進(jìn)而影響其功能。越來(lái)越多的研究表明,Pin1非常有望成為一個(gè)抗癌藥物研究的新靶點(diǎn)。因此,Pin1抑制劑的研發(fā)已成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。 Pin1抑制劑主要分為擬肽類(lèi)抑制劑和小分子抑制劑兩種,由于擬肽類(lèi)抑制劑很難應(yīng)用于臨床,所以目前研究的主要方向是小分子抑制劑。雖然經(jīng)過(guò)多年來(lái)的努力,小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)層出不窮,其中有些抑制劑對(duì)酶的抑制活性也可以達(dá)到納摩爾水平,但由于理化性質(zhì)等種種原因,迄今為止,仍沒(méi)有特異有效的Pin1抑制劑可以進(jìn)入臨床研究。因此,尋找新型結(jié)構(gòu)的小分子Pin1抑制劑至關(guān)重要。 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所合成室的徐柏玲老師課題組,根據(jù)Pin1酶及其底物的結(jié)構(gòu)特征,結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬的分子對(duì)接技術(shù),設(shè)計(jì)合成了一系列完全創(chuàng)新結(jié)構(gòu)的小分子化合物。本論文采用MTT法及成功建立的蛋白酶偶聯(lián)的PPIase活性檢測(cè)方法對(duì)這些化合物進(jìn)行了評(píng)價(jià),并對(duì)其中代號(hào)為XP08075的化合物,進(jìn)行了初步的抗腫瘤作用機(jī)制研究。 首先,檢測(cè)了10種不同組織來(lái)源的19株腫瘤細(xì)胞中Pin1的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn),Pin1在人前列腺癌、胃癌、宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)較高,而在人肝癌HepG2中表達(dá)最低。因此,選擇HepG2細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染對(duì)象,成功構(gòu)建了Pin1過(guò)表達(dá)的HepG2腫瘤細(xì)胞模型。 由于MTT法可以快速評(píng)價(jià)化合物的體外抗腫瘤作用,所以首先應(yīng)用MTT法對(duì)294個(gè)化合物進(jìn)行了初步篩選。結(jié)果表明,49個(gè)化合物IC5o在微摩爾水平。繼而,在對(duì)其中9個(gè)化合物進(jìn)行復(fù)篩后我們發(fā)現(xiàn),XP08075對(duì)各株腫瘤細(xì)胞均有較好的抑制作用,并且腫瘤細(xì)胞對(duì)XP08075的敏感性與其Pin1表達(dá)相關(guān)。因此,又進(jìn)一步檢測(cè)了XP08075在構(gòu)建的Pin1過(guò)表達(dá)HepG2細(xì)胞模型上的作用。結(jié)果表明,XP08075對(duì)過(guò)表達(dá)Pin1的HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,明顯高于轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照細(xì)胞。 為了從分子水平闡明此類(lèi)結(jié)構(gòu)的化合物是否在體外能直接抑制Pin1酶的活性,建立了蛋白酶偶聯(lián)的Pin1活性檢測(cè)方法,并對(duì)包括XP08075在內(nèi)的51個(gè)化合物進(jìn)行了酶學(xué)水平的檢測(cè)。其中,9個(gè)化合物對(duì)Pinl酶的IC50達(dá)到了微摩爾水平。在溶解性相對(duì)較好的情況下,XLN418表現(xiàn)出了較高的Pinl抑制活性,IC50為4.9μmol/L,但XP08075對(duì)酶的抑制作用不強(qiáng)。 在分析比較了細(xì)胞、分子水平有效的化合物的結(jié)構(gòu)特征之后,發(fā)現(xiàn),絕大多數(shù)細(xì)胞水平有作用的化合物,取代基都是酯,而酶學(xué)水平有作用的化合物,取代基都是羧酸。XLN418和XP08075的唯一區(qū)別是,R3取代基,XLN418是甲酸而XP08075是甲酯。另兩對(duì)化合物也出現(xiàn)了同樣的情況。因此推測(cè),含酯鍵的化合物在進(jìn)入細(xì)胞后,可能部分被酯酶水解變成了帶羧酸的化合物,通過(guò)抑制Pin1的活性而發(fā)揮其抗腫瘤作用。而含羧酸的化合物,由于極性大不容易透過(guò)細(xì)胞膜,所以在細(xì)胞水平?jīng)]有抑制活性�；谏鲜鐾茰y(cè),以人乳腺癌細(xì)胞MCF-7為研究對(duì)象,對(duì)XP08075的抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了初步探討。 流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示,6μmol/L的XP08075作用于MCF-724、48和72h,不會(huì)對(duì)周期分布產(chǎn)生明顯影響,只是在作用72h后出現(xiàn)了輕微了Go/G1期比例的增加。根據(jù)生長(zhǎng)曲線計(jì)算得到的細(xì)胞倍增時(shí)間顯示,6μmol/L的XP08075可以顯著增加MCF-7細(xì)胞的倍增時(shí)間,導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞周期進(jìn)程的延長(zhǎng)。 繼而,通過(guò)VVestern Blot法檢測(cè)了XP08075處理MCF-7細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的變化。我們觀察到,Pin1間接調(diào)控的β-catenin以及CyclinBl的蛋白表達(dá)出現(xiàn)了時(shí)間依賴(lài)性下降。但同時(shí),Pin1的蛋白含量也出現(xiàn)了明顯降低。通過(guò)相同條件處理細(xì)胞,RT-PCR分析,我們發(fā)現(xiàn),這種蛋白表達(dá)的降低很大程度上是源于Pin1降解的增多。 因此,XP08075可能經(jīng)過(guò)細(xì)胞內(nèi)的酯解,部分變成了XLN418,通過(guò)對(duì)Pin1蛋白及活性的抑制,發(fā)揮其抗腫瘤作用。 綜上所述,XLN418有望成為Pin1抑制劑的一個(gè)先導(dǎo)化合物,為該類(lèi)結(jié)構(gòu)Pin1抑制劑的研究奠定了基礎(chǔ)。 XLN306是我所徐柏玲老師課題組合成的新型結(jié)構(gòu)小分子化合物,旨在研究以Pin1為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物。前期研究結(jié)果表明,XLN306雖然沒(méi)有很強(qiáng)抑制Pin1酶的活性,但對(duì)不同腫瘤細(xì)胞均有較好的生長(zhǎng)抑制作用,IC50在微摩爾水平,其中對(duì)人乳腺癌MX-1的生長(zhǎng)抑制作用相對(duì)較強(qiáng)。因此,本研究采用MX-1作為體外研究對(duì)象,旨在探討XLN306較確切的抗腫瘤作用機(jī)制。 首先,我們以細(xì)胞周期為切入點(diǎn),檢測(cè)了XLN306對(duì)MX-1細(xì)胞周期分布的影響。結(jié)果顯示,XLN306可使細(xì)胞出現(xiàn)劑量依賴(lài)及時(shí)間依賴(lài)性的凋亡增加。提示XLN306的抗腫瘤作用,很可能源于其誘導(dǎo)凋亡作用。為了深入探討其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制,我們從體內(nèi)、外水平,針對(duì)凋亡的不同途徑及作用環(huán)節(jié)進(jìn)行了較系統(tǒng)深入地研究。 通過(guò)DAPI染色法及DNA ladder實(shí)驗(yàn),本研究從形態(tài)學(xué)及生物化學(xué)的角度觀察到,XLN306可以誘導(dǎo)MX-1細(xì)胞凋亡,出現(xiàn)明顯的染色質(zhì)濃縮和核碎裂現(xiàn)象,細(xì)胞內(nèi)核小體DNA斷裂呈現(xiàn)典型的梯形條帶。 Western Blot結(jié)果表明,XLN306可以通過(guò)上調(diào)Fas和FasL的表達(dá),降低Bcl-2/Bax比例、促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放,同時(shí)啟動(dòng)死亡受體通路和線粒體通路這兩條經(jīng)典的凋亡通路,進(jìn)一步活化Caspase3,導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。另外,20μmol/L的XLN306還可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞存活通路中重要蛋白Akt的磷酸化,通過(guò)下調(diào)Akt的活性,活化GSK3β,從而促進(jìn)凋亡的發(fā)生。 為了從體內(nèi)水平探討XLN306的抗腫瘤作用,進(jìn)行了小鼠肝癌H22移植瘤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,XLN306可以顯著抑制移植瘤的生長(zhǎng),且具有很好的量效關(guān)系。 綜上所述,體內(nèi)、外研究均表明,XLN306具有良好的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用,其機(jī)制與同時(shí)啟動(dòng)死亡受體、線粒體通路,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2395193